臨床上常見(jiàn)牙周病、外傷、腫瘤、先天性唇腭裂形成的牙槽嵴裂等各種原因造成的不同程度、不同范圍的牙槽骨缺損,采取什么樣的治療方式,才能達(dá)到形態(tài)、功能和美觀的完美修復(fù),這是口腔界的一大難題。目前主要采用骨移植手術(shù)對(duì)骨缺損部位進(jìn)行修復(fù)。從修復(fù)效果看,使用自體骨進(jìn)行移植修復(fù)無(wú)疑是首選方案,但自體骨移植手術(shù)會(huì)因取材,給患者帶來(lái)二次創(chuàng)傷。為減輕患者的創(chuàng)傷痛苦,臨床上采用同種異體骨、異種骨、以及金屬合金、高分子聚合物等人工骨作為代替材料進(jìn)行移植修復(fù),達(dá)到了一定的修復(fù)目的,但同時(shí)也需要面對(duì)相應(yīng)的免疫排斥、組織相容、疾病交叉?zhèn)鞑ァ⒁约安牧仙飳W(xué)或力學(xué)性能等方面潛在的問(wèn)題。骨組織工程為牙槽骨缺損的修復(fù)提供了新的方向。骨組織工程是將醫(yī)學(xué)原理與工程技術(shù)結(jié)合,在各種因子的誘導(dǎo)下,使接種于支架材料上的細(xì)胞不斷增殖,逐漸達(dá)到修復(fù)骨缺損的目的,其關(guān)鍵要素為細(xì)胞、支架、誘導(dǎo)因子。相關(guān)研究表明,骨髓間充質(zhì)細(xì)胞可在適宜的條件下分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等,是組織工程理想的種子細(xì)胞,但如何調(diào)控定向分化仍屬難題。生物玻璃在促進(jìn)組織修復(fù)方面具有突出的理化性能,采用纖維沉積設(shè)備打印溶膠-凝膠型微納米生物活性玻璃三維多孔支架,可以在保證力學(xué)性能的前提下,通過(guò)微玻璃球堆疊自然形成微納米級(jí)孔隙,有利于促進(jìn)細(xì)胞的黏附、遷移和分化,賦予生物活性玻璃支架更優(yōu)異的性能;同時(shí)纖維沉積技術(shù)避免了常規(guī)的熱熔,有利于保留材料的生物活性或可能添加的生物因子;3D打印可以制備具有特定幾何形狀、尺寸和內(nèi)部級(jí)孔結(jié)構(gòu)多樣化的三維支架,以滿足臨床上的不同需求。殼聚糖(ChitosanCS)是一種具有生物特性的優(yōu)質(zhì)載體,神經(jīng)表皮生長(zhǎng)因子樣蛋白-1(Nel-liketypeⅠmolecular-1,NELL1)是一個(gè)新型有效的成骨因子,其相關(guān)研究正在探索完善中。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建負(fù)載NELL-1的DNA(pDNA-NELLl)的CS納米粒,將此納米粒與3D打印的溶膠-凝膠型微納米生物活性玻璃(3D printed and sol-gel micro-nano bioactive glasses,BG)進(jìn)行復(fù)合,以恒河猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作為種子細(xì)胞、pDNA-NELL1 作為誘導(dǎo)因子、BG為支架,復(fù)合構(gòu)成組織工程骨材料,植入到已制備的恒河猴牙槽骨缺損區(qū)模型中,以評(píng)價(jià)該組織工程植骨材料的原位成骨能力,觀察BMSCs介導(dǎo)下基因修飾型微納米生物玻璃復(fù)合材料對(duì)恒河猴牙槽大面積骨缺損的再生修復(fù)效果,以及檢測(cè)再生部位牙槽骨的骨修復(fù)情況,以期為臨床上修復(fù)不同幾何形狀、不同尺寸大小的牙槽骨、乃至其他部位的骨缺損,提供一種更有效、可行的組織工程骨材料,使組織工程骨修復(fù)向個(gè)性化的發(fā)展邁出一大步。本實(shí)驗(yàn)分為以下兩個(gè)部分:第一部分BMSCs介導(dǎo)3D打印微納米生物活性玻璃三維多孔支架復(fù)合NELL1-DNA組織工程骨材料的制備目的:構(gòu)建和制備新型組織工程牙槽骨材料——BMSCs介導(dǎo)3D打印微納米生物活性玻璃三維多孔支架復(fù)合NELL1-DNA的組織工程骨(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs),并完成實(shí)驗(yàn)分組。方法:1.本實(shí)驗(yàn)中所用的3D打印微納米生物活性玻璃支架是由華南理工大學(xué)國(guó)家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心提供,針對(duì)本實(shí)驗(yàn)的特殊性和要求,綜合采用溶膠-凝膠技術(shù)與有機(jī)模板自組裝技術(shù)制備介孔生物玻璃微球,以直徑為350 nm左右的生物活性玻璃微球?yàn)榇蛴〔牧稀⒕垡蚁┐紴檎辰Y(jié)劑,采用纖維沉積設(shè)備打印生物活性玻璃三維多孔支架,成功制備出10mm×10mm×5mm長(zhǎng)方體生物玻璃支架,孔徑長(zhǎng)寬為250 μm,并在支架表面涂覆高濃度PBS緩沖液和海藻酸鈉磷酸鹽復(fù)合液形成K3CaH(P04)2沉積表面,以最大程度的增強(qiáng)生物活性玻璃支架材料的抗壓強(qiáng)度,并具有良好的體外磷灰石形成活性。該生物活性玻璃支架能夠提供骨組織修復(fù)過(guò)程中促進(jìn)骨細(xì)胞增殖需要的微孔尺寸在150-500 μ m范圍內(nèi)、孔隙率不小于40%的連通多孔的三維環(huán)境,且具有良好的生物活性和可降解性,其相關(guān)性能該研究中心已做過(guò)完善的實(shí)驗(yàn)及研究并已發(fā)表成果。2.培養(yǎng)恒河猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs):穿刺抽取恒河猴骨髓,將其放在含有10%的胎牛血清和1%的雙抗的DMEM/F12的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),使骨髓組織貼壁生長(zhǎng),收集傳代培養(yǎng)第3、4代細(xì)胞。顯微鏡下觀察BMSCs的生長(zhǎng)方式及形態(tài)學(xué)變化、染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSCs成骨分化能力,CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力。3.制備殼聚糖包載pDNA-NELL1納米粒:將10g殼聚糖溶于360mL的NMP(1-甲基-2-吡略烷酮),攪拌下加入35mL15%NaOH、57.5mLCH3I。經(jīng)過(guò)沉淀獲取TMC。取0.4 mL pDNA-NELL1溶于骨涎蛋白溶液(BSP)中,配成濃度為0.5mg/mL的DNA溶液,將0.4mL此溶液加入離心管中,然后加入1.2mL濃度1mg/mL TMC的BSP溶液,混合震蕩后制備出N/P值為10的載pDNA-NELL1的納米顆粒溶液(CSn)。4.BMSCs介導(dǎo)3D打印溶膠-凝膠型生物活性玻璃三維支架復(fù)合NELL1組織工程骨材料的制備,實(shí)驗(yàn)分組。所有支架均經(jīng)過(guò)預(yù)處理,準(zhǔn)備濃度為1mg/mL的殼聚糖溶液、濃度為5×106 cells/mL的BMSCs細(xì)胞懸浮液,開(kāi)始分組制備組織工程骨。實(shí)驗(yàn)分4組,對(duì)照組3組和實(shí)驗(yàn)組。Ⅰ.對(duì)照組1(BG):220 μL生理鹽水滴加到BG支架上,浸潤(rùn)4-6個(gè)小時(shí),接著滴加200 μL生理鹽水(與下面各組滴加的細(xì)胞懸浮液等量)。Ⅱ.對(duì)照組2(BG+BMSCs):220 μL生理鹽水滴加到BG支架上,浸潤(rùn)4-6個(gè)小時(shí),接著滴加200 μL BMSCs細(xì)胞懸浮液。Ⅲ.對(duì)照組3(BG\CSn+BMSCs):先混合200 μL殼聚糖溶液和20 μL生理鹽水,渦旋震蕩30秒,將混合液220 μL滴加到BG支架上,浸潤(rùn)4-6個(gè)小時(shí),接著滴加200 μL BMSCs細(xì)胞懸浮液。Ⅳ.實(shí)驗(yàn)組(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs):先混合200 μL殼聚糖溶液和20 μ L殼聚糖包載的pDNA-NELL1納米粒混合液,渦旋震蕩30秒,將此混合液220 μL滴加到BG支架上,浸潤(rùn)4-6個(gè)小時(shí),接著滴加200 μL BMSCs細(xì)胞懸浮液。上述操作步驟保障對(duì)照組2、3和實(shí)驗(yàn)組的支架材料中均種有1 × 106個(gè)細(xì)胞。結(jié)果:1.電鏡下支架成微球狀排列,BG微球表明粗糙,BMSCs細(xì)胞粘附于支架。2.顯微鏡下觀察恒河猴BMSCs體外培養(yǎng)期細(xì)胞形態(tài)變化,細(xì)胞傳代至第三代時(shí)細(xì)胞呈紡錘樣,形成輻射或旋渦樣的緊密排列。堿性磷酸酶、茜素紅染色實(shí)驗(yàn)均呈陽(yáng)性,證明BMSCs在體外誘導(dǎo)成功向成骨細(xì)胞分化。3.成功制備大小為10mm×10mm×5mm組織工程牙槽骨材料,并分為4組,BG、BG+BMSCs、BG\CSn + BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs。結(jié)論:以恒河猴BMSCs作為種子細(xì)胞、NELL1作為細(xì)胞因子、3D打印的溶膠-凝膠型生物活性BG為支架,可制備出新型的BMSCs介導(dǎo)3D打印生物活性玻璃三維支架復(fù)合NELL1基因的組織工程牙槽骨骨材料。第二部分組織工程骨修復(fù)恒河猴牙槽骨缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)—恒河猴牙槽骨缺損模型的組織工程修復(fù)目的:恒河猴牙槽骨缺損模型的組織工程修復(fù),用于檢測(cè)組織工程材料修復(fù)牙槽骨缺失模型的可行性,以及為后續(xù)觀察和評(píng)價(jià)組織工程牙槽骨的修復(fù)能力建造平臺(tái)。方法:1.建立牙槽骨缺損模型:4只成年雌性恒河猴,隨機(jī)編號(hào)A、B、C、D號(hào),上下左右頜骨按照口腔國(guó)際區(qū)域編碼為1、2、3、4四個(gè)象限,共計(jì)16個(gè)牙槽骨實(shí)驗(yàn)區(qū)。術(shù)前24小時(shí)禁食禁水,全身麻醉,消毒,分別拔除ABCD猴的四個(gè)象限的第一、二前磨牙,磨除拔牙窩周邊骨及頰側(cè)骨皮質(zhì),保留舌側(cè)的骨皮質(zhì),建立約10mm×10mm×5mm大小的、共計(jì)16個(gè)的牙槽骨缺損區(qū)。2.組織工程牙槽骨材料植入手術(shù):在ABCD猴的4個(gè)牙槽骨缺損區(qū)分別隨機(jī)植入4種骨材料(BG、BG+BMSCs、BG\CSn+BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs),但保證每只恒河猴的每個(gè)牙槽骨缺損區(qū)植入的骨材料是不同的,以消除不同猴之間、不同牙槽骨缺損區(qū)之間的差異。植入組織工程骨后,缺損縫合,嚴(yán)密覆蓋植入的組織工程牙槽骨。3.術(shù)后行X光檢查,檢查植骨材料的植入情況。4.術(shù)后護(hù)理:牙齦縫合后局部消毒,術(shù)后2周給予軟食。術(shù)后連續(xù)7天全身用藥抗感染。術(shù)后每天兩次用2%洗必泰50 mL口腔沖洗和手術(shù)部位消毒,持續(xù)2周。5.術(shù)后觀察:ABCD猴的日常活動(dòng)、飲食、情緒有無(wú)異常,傷口有無(wú)紅腫、滲出等炎癥反應(yīng),以及有無(wú)化膿、壞死等并發(fā)癥的發(fā)生。若無(wú)異常,2周后拆線。結(jié)果:1.在A、B、C、D猴的四個(gè)象限分別建立牙槽骨缺損模型,并將4種骨材料(BG、BG+BMSCs、BG\CSn+BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)分別成功植入牙槽骨缺損區(qū),每只猴的每個(gè)象限所植入的材料均不同。2.X光片示:ABCD猴的4個(gè)牙槽骨缺損區(qū)均有骨材料植入。3.術(shù)后2周加強(qiáng)護(hù)理,2周內(nèi)觀察到ABCD猴的日�；顒�(dòng)、飲食、情緒無(wú)異常,傷口無(wú)紅腫、滲出等炎癥反應(yīng),無(wú)化膿、壞死等并發(fā)癥的發(fā)生。2周后拆線。結(jié)論:成功在ABCD猴的四個(gè)象限建立牙槽骨缺損模型,并將4種骨材料(BG、BG+BMSCs、BG\CSn+BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)分別植入牙槽骨缺損區(qū),術(shù)后兩周無(wú)炎癥反應(yīng)和并發(fā)癥發(fā)生。實(shí)驗(yàn)二:組織工程骨修復(fù)牙槽骨缺損動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑u(píng)價(jià)目的:組織工程牙槽骨材料植入恒河猴牙槽骨缺損區(qū)術(shù)后12周,二次手術(shù),觀察、檢測(cè)新型組織工程骨材料對(duì)恒河猴牙槽骨缺損的修復(fù)效果,評(píng)價(jià)其成骨性能。方法:1.植入材料術(shù)后12周,植骨區(qū)拍攝X光片。2.二次手術(shù),術(shù)中觀察植骨區(qū),并取ABCD猴的四個(gè)象限的植骨區(qū)骨:術(shù)前24小時(shí)禁食禁水,全身麻醉,消毒,分別拔除ABCD猴的四個(gè)象限的尖牙,翻瓣后觀察植骨區(qū),然后取骨,取骨的范圍大于第一次手術(shù)的植骨區(qū),分離出15mm×12mm×7mm大小骨塊,標(biāo)號(hào)。3.Micro-CT三維重建以觀測(cè)骨組織內(nèi)部的修復(fù)情況。4.組織學(xué)檢查:將標(biāo)本置于10%甲醛水溶液中固定7天。共計(jì)16個(gè)骨標(biāo)本。固定后包埋切片,HE染色。結(jié)果:1.X線結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)顯示植骨材料與周邊骨界線不清,植骨材料幾乎被完全吸收改建,骨小梁結(jié)構(gòu)清晰,數(shù)目較多,呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均勻排列,骨皮質(zhì)比較均勻連續(xù),牙槽嵴高度比對(duì)照組都高,牙槽嵴頂高度幾乎與周邊自體骨相一致,植骨區(qū)呈大范圍的高密度阻射陰影區(qū)。對(duì)照組1(BG)顯示植骨材料與周邊骨界線較清楚。越接近周邊骨的材料吸收改建,可見(jiàn)稀松的骨小梁結(jié)構(gòu)散在排列。近牙槽嵴頂可清晰看到植骨材料。對(duì)照組2(BG+BMSCs)顯示植骨材料與周邊骨界線不清,植骨材料幾乎被完全吸收改建,骨小梁結(jié)構(gòu)清晰,但數(shù)目較少,散在排列。牙槽嵴頂呈U型,最凹處低于周圍自體骨高度。對(duì)照組3(BG\CSn+BMSCs)顯示植骨材料與周邊骨界線不清,植骨材料幾乎被完全吸收改建,骨小梁結(jié)果清晰,數(shù)目較少但比BG+BMSCs組多,散在排列。牙槽嵴頂呈U型,最凹處低于周圍自體骨高度,植骨區(qū)阻射陰影密度高于BG+BMSCs組。2.術(shù)中翻瓣后,肉眼可觀察到有新骨形成,新骨的大小和植入材料相類似,可觀察到新生骨與周圍正常骨組織分界不明顯,新骨表面較光滑平整沒(méi)有明顯的凹陷或者凸起,表面并有骨膜覆蓋。3.Micro-CT三維重建圖像顯示,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都有新骨生成,實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組骨小梁更加粗大,骨小梁排列更緊密,骨密度更高。BG組見(jiàn)骨小梁形成凌亂稀疏無(wú)規(guī)則,可觀察到有空洞形成。BG+BMSCs組和BG\CSn+BMSCs組植骨區(qū)骨小梁結(jié)構(gòu)清晰,數(shù)量較多,均未發(fā)現(xiàn)空洞,新骨與周邊骨形成整合,觀察不到明顯界線,骨缺損愈合良好。4.組織切片HE顯示,實(shí)驗(yàn)組(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)顯示新生骨組織與周邊骨完全融合,形成致密的新骨,有大量成熟的骨細(xì)胞。BG組新骨形成有大量的空腔和結(jié)締組織,骨細(xì)胞形成數(shù)量少,位置比較稀疏。BG+BMSCs組和BG\CSn+BMSCs組新骨密度、數(shù)量低于實(shí)驗(yàn)組,但都高于BG組,空腔和結(jié)締組織的數(shù)量小于BG組。結(jié)論:構(gòu)建的組織工程骨材料BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs植入恒河猴牙槽骨缺損區(qū)實(shí)驗(yàn)中,肉眼、X-ray及Micro-CT觀察顯示新生骨量、密度、硬度、結(jié)構(gòu)與正常骨極為接近,骨皮質(zhì)光滑與周邊正常骨連接緊密。組織學(xué)觀察顯示缺損區(qū)炎反應(yīng)小,新生組織結(jié)果接近正常骨,有效促進(jìn)恒河猴牙槽骨缺損的修復(fù)。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R318.08;R782.1
【部分圖文】：

圖３：邋ＢＭＳＣｓ接種第８天的形態(tài)（細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形）逡逑

圖２：邋ＢＭＳＣｓ接種第４天的形態(tài)（細(xì)胞呈多角形）逡逑培養(yǎng)至第７－９天細(xì)胞融合至８５％左右時(shí)，細(xì)胞體積有所增大，細(xì)胞形態(tài)較均逡逑

Ａ邐ｘ邋１００邐Ｂ邐Ｘ２００逡逑圖１：邋ＢＭＳＣｓ提取第１天的形態(tài)（細(xì)胞呈圓形）逡逑胞ＢＭＳＣｓ體外培養(yǎng)在顯微鏡下的形態(tài)動(dòng)態(tài)觀察逡逑，除去未貼壁生長(zhǎng)的雜質(zhì)細(xì)胞。三天后可見(jiàn)在器皿壁出一－

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2817337