無標(biāo)記光學(xué)顯微成像技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要組成部分。然而,由于光學(xué)衍射極限的限制,能應(yīng)用于細胞或組織的超高分辨成像技術(shù)仍面臨巨大挑戰(zhàn)�；跓晒鈽�(biāo)記的顯微成像技術(shù)可以通過對外源標(biāo)記分子的操控,間接實現(xiàn)包括蛋白質(zhì)、核酸在內(nèi)的多種生物分子的特異性超分辨成像。但是熒光標(biāo)記分子通常較大,會干擾對細胞性質(zhì)的研究。當(dāng)前,能夠直接探測固有生物分子,產(chǎn)生圖像對比度的無標(biāo)記高分辨顯微成像技術(shù)有了飛速的發(fā)展。例如自發(fā)拉曼光譜成像技術(shù)已經(jīng)開始廣泛應(yīng)用于生物系統(tǒng)的生化分析和成像,但是自發(fā)拉曼的采集速度相對較慢,分辨率以及靈敏度都有待進一步提高。隨著技術(shù)的發(fā)展,受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering,SRS)顯微成像技術(shù)逐漸成熟,該技術(shù)對生物體的成像速度更快,靈敏度更高。然而,SRS作為一種無標(biāo)記分子振動成像技術(shù),其空間分辨率一直被限制在300納米左右。因此,能夠突破180納米傳統(tǒng)空間分辨極限的無標(biāo)記超高分辨光學(xué)成像一直是成像領(lǐng)域開拓的重要方向。本文將探討橫向分辨率接近130納米的近共振增強無標(biāo)記受激拉曼散射顯微成像技術(shù),其高分辨率圖像的對比度直接來源于低濃度的內(nèi)源性生物分子。通過雙波長倍頻技術(shù),本文首次實現(xiàn)了基于可見光波段的SRS成像系統(tǒng)。相比于近紅外SRS,可見光SRS過程中,分子被泵浦光所激發(fā)到的虛態(tài)更加接近上一級電子激發(fā)態(tài),因此,該過程中的拉曼散射截面更大,成像靈敏度相比傳統(tǒng)SRS顯微鏡提高了約23倍。此外,我們通過在光路中引入一根0.3米長的單模保偏光纖,實現(xiàn)了基于光譜聚焦技術(shù)的超光譜SRS顯微成像,使小范圍內(nèi)的化學(xué)分析成為可能。不僅如此,光纖的引入還保證了泵浦光和斯托克斯光具有絕對的共線性,穩(wěn)定性以及較好的高斯光模式輸出,為高分辨成像提供了保證。最后,基于空間分辨率和成像靈敏度的提高,本文展示了超精細的單細胞三維成像以及大范圍未經(jīng)染色處理的鼠腦組織切片的高分辨成像結(jié)果。除此之外,我們還利用高分辨超光譜SRS顯微鏡觀察到了鞘磷脂在腦組織中的分布情況。本文的研究進一步推進了SRS成像技術(shù)的發(fā)展,為分辨率～130納米的無標(biāo)記高分辨生物醫(yī)學(xué)成像提供了新的平臺。
【學(xué)位單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R318;TP391.41
【部分圖文】：

在這種相互作用中，絕大部分入射光子與樣本分子發(fā)生彈性碰撞，入射頻率不逡逑會發(fā)生變化。此時，激發(fā)極化也不會改變分子原始的振動狀態(tài)，因此大多數(shù)散射光逡逑子具有與入射光子相同的能量（Ｒａｙｌｅｉｇｈ散射，圖１－１）。然而，當(dāng)入射轄射誘導(dǎo)極逡逑化與分子的化學(xué)鍵振動變化耦合時，光子會發(fā)生非彈性散射（拉曼散射，圖１－１）。逡逑對于一個可以產(chǎn)生拉曼散射的化學(xué)分子來講，其化學(xué)鍵的極化率會有相應(yīng)的變化，逡逑這樣，在振動核附近的電子密度就會產(chǎn)生相應(yīng)畸變。因此，多重鍵或富電子基團（如逡逑ＣＣ，ＯＮ和００）的振動產(chǎn)生的拉曼帶比單鍵或缺電子基團的振動更強烈。逡逑自發(fā)拉曼散射效應(yīng)中，光子會將樣本分子從基態(tài)激發(fā)到虛態(tài)，如圖１－２，處于逡逑虛態(tài)的分子自發(fā)降落到電子基態(tài)時，其振動能級或轉(zhuǎn)動能級可能發(fā)生變化，伴隨這逡逑個過程放出的光子將具有和激發(fā)光子不同的頻率。如果分子最終狀態(tài)的能量大于初逡逑始狀態(tài)的能量，則放出的光子能量小于激發(fā)光子的能量，新光子稱為斯托克斯光，逡逑頻率的改變稱為斯托克斯位移。相反

誘導(dǎo)樣本中所有的化學(xué)鍵共振來獲得拉曼譜，由于細胞中不同成分的化學(xué)鍵組成不逡逑同，它們的拉曼譜也各不相同，通過記錄每個像素點的拉曼光譜，利用目標(biāo)分子的逡逑特征峰即可完成對特定化學(xué)成分的特異性成像。如圖１－３為牛血清白蛋白（ＢＳＡ）逡逑以及三油酸甘油酷（Ｇｌｙｃｅｒｙｌ邋ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）的自發(fā)拉曼譜。值得注意的是，１８００－２８００逡逑ｃｎｒ１為生物體拉曼振動譜的靜默區(qū)，細胞在此區(qū)域內(nèi)沒有拉曼峰。逡逑２－°１邐１邋＂ｓ逡逑＾邐邐Ｇｉｙｃｃｉｙｌ邋ｄｉｏｌｃａｔｃ邐＂邋５逡逑＝：邐邐ＢＳＡ邐ｒ逡逑ｉｒ邋ｉ邋ｉ邐＼［邋ｓ逡逑Ｉ。５：邐Ａ逡逑氣。逡逑１２００邐１Ｍ）０邐１８００邐２７００邐３０００逡逑Ｒａｍａｎ邋ｓｈｉｆｔ邋（ｃｍ＇１）逡逑圖１－３邋ＢＳＡ與ＴＯ的自發(fā)拉曼譜逡逑雖然自發(fā)拉曼光譜已經(jīng)被廣泛地使用，但是拉曼散射是一種非常微弱的效應(yīng)，逡逑其散射截面為？ｌＯ－Ｍｃｍｈｒ—１，比熒光低約十個數(shù)量級［６］，成像時需要非常長的積分逡逑時間，這樣，緩慢的采集速度、較差的分辨率和靈敏度的缺乏阻礙了自發(fā)拉曼成像逡逑方法進一步的發(fā)展，不能應(yīng)用于快速的生物過程研宄，限制了拉曼成像方法在生物逡逑４逡逑

｜＾ａｍａｎ邋美：，，vq逡逑＾＾＾＾＾Ｖｉｂｒａｔｉｏｎ邋ｂｏｎｄｓ逡逑圖１－２自發(fā)拉曼散射能級圖逡逑自１９９０年Ｐｕｐｐｅｌｓ及其同事在活細胞及染色體的拉曼光譜檢測方面上的開創(chuàng)性逡逑工作以來，自發(fā)拉曼光譜己被越來越多地用作分析細胞及其組分的重要平臺Ｗ。由逡逑于拉曼散射是一種非侵入性技術(shù)，使用相對低的激發(fā)光能量，對樣本產(chǎn)生非常小的逡逑擾動，所以，拉曼光譜適用于活體分析。通過固定波長的激光激發(fā)樣本，可以同時逡逑誘導(dǎo)樣本中所有的化學(xué)鍵共振來獲得拉曼譜，由于細胞中不同成分的化學(xué)鍵組成不逡逑同，它們的拉曼譜也各不相同，通過記錄每個像素點的拉曼光譜，利用目標(biāo)分子的逡逑特征峰即可完成對特定化學(xué)成分的特異性成像。如圖１－３為牛血清白蛋白（ＢＳＡ）逡逑以及三油酸甘油酷（Ｇｌｙｃｅｒｙｌ邋ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）的自發(fā)拉曼譜。值得注意的是，１８００－２８００逡逑ｃｎｒ１為生物體拉曼振動譜的靜默區(qū)，細胞在此區(qū)域內(nèi)沒有拉曼峰。逡逑２－°１邐１邋＂ｓ逡逑＾邐邐Ｇｉｙｃｃｉｙｌ邋ｄｉｏｌｃａｔｃ邐＂邋５逡逑＝：邐邐ＢＳＡ邐ｒ逡逑ｉｒ邋ｉ邋ｉ邐＼［邋ｓ逡逑Ｉ。５：邐Ａ逡逑氣。逡逑１２００邐１Ｍ）０邐１８００邐２７００邐３０００逡逑Ｒａｍａｎ邋ｓｈｉｆｔ邋（ｃｍ＇１）逡逑圖１－３邋ＢＳＡ與ＴＯ的自發(fā)拉曼譜逡逑雖然自發(fā)拉曼光譜已經(jīng)被廣泛地使用

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