【摘要】：椎間盤退變性疾病是一種嚴重危害人類健康的疾病,可引起神經(jīng)壓迫和損害,其導(dǎo)致的腰背痛是目前造成勞動力喪失的主要原因。椎間盤退變性相關(guān)疾病的治療方法很多,包括功能鍛煉、藥物治療、物理治療和手術(shù)等,保守治療無效時最終選擇仍是手術(shù)治療。切除突出的椎間盤組織和椎間融合手術(shù)是傳統(tǒng)的手術(shù)方式,但存在難以恢復(fù)運動荷載的問題,從而導(dǎo)致患者功能恢復(fù)差。植入人工椎間盤或人工髓核能有效復(fù)原椎間盤高度,從而部分恢復(fù)椎間盤的解剖和運動功能,改善術(shù)后患者的生活質(zhì)量。然而,目前植入的人工椎間盤和髓核的材料還存在缺陷,與周圍組織相融效果不佳,可能使植入物脫出或移位,從而導(dǎo)致并發(fā)癥的發(fā)生。組織工程和再生醫(yī)學策略在解決上述問題中體現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢,組織工程技術(shù)可在仿生天然纖維環(huán)中制作出類似人體膠原纖維結(jié)構(gòu),靜電紡絲技術(shù)可以制成接近自然解剖特點的組織工程纖維環(huán)組織,而且能有效地促進植入物周圍組織再生,使植入物與周圍組織融合為一個整體,從而部分解決骨與臨近纖維環(huán)組織整體性的問題。然而,上述技術(shù)制成的組織工程纖維環(huán)還不完善,目前無法應(yīng)用于臨床。面臨的主要問題包括靜電紡絲技術(shù)制成的纖維環(huán)支架材料,細胞難以長入支架內(nèi)部,且難以誘導(dǎo)種子細胞向內(nèi)外層纖維環(huán)細胞定向分化,并且由于分化機制不明,難以定向調(diào)控。聚已內(nèi)酯等材料等類似纖維電紡產(chǎn)品強度不夠,某些產(chǎn)品降解速率不可控,并且其促進組織再生的機制尚不明確。為了研究能應(yīng)用于椎間盤突出臨床實踐的組織工程仿生材料,本課題組前期對聚乳酸/聚已內(nèi)酯(Poly(L-Lactide)/Polycaprolactone,PLLA/PCL)材料進行了研究,結(jié)果顯示這種材料具有優(yōu)良的力學性能、有效的表面活性與降解速率可調(diào)控性等優(yōu)勢。為了繼續(xù)深入研究和優(yōu)化支架材料,使之向臨床應(yīng)用進一步推進,我們對PLLA/PCL材料配置比例及制作方法進行了改進,制備了的三種不同結(jié)構(gòu)的納米纖維材料進行了比較研究,優(yōu)化了細胞長入條件,并探索了不同結(jié)構(gòu)材料促進組織再生的可能機制。本研究中,我們首先制備了納米紗(Aligned Nanoyarn/Nanofibrous Scaffold,AYS)、取向納米纖維支架(A1igned Nanofibrous Scaffold,AFS)和三維多孔納米纖維支架(Three-dimensional porous Nanofibrous Scaffold,3DPS)3種不同結(jié)構(gòu)的納米纖維材料,隨后將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cell,BMSC)體外接種至這3種材料中,檢測BMSC在支架材料中黏附、生長、增殖和細胞活性;將AYS、AFS、3DPS材料種植于大鼠皮下,觀察囊壁厚度、異物巨細胞的形態(tài)數(shù)目,檢測炎性因子基因表達水平,評價三種材料的生物相容性;比較普通培養(yǎng)方法、間歇離心法以及生物反應(yīng)器動態(tài)培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSC的效果,觀察細胞存活、生長和分布情況,優(yōu)化體外培養(yǎng)方法;體外靜態(tài)培養(yǎng)BMSC,觀察細胞在三種納米纖維支架中的形態(tài)、黏附、增殖、分化等行為,比較纖維環(huán)細胞相關(guān)表型分子(COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9)mRNA表達水平和細胞內(nèi)FAK信號通路相關(guān)蛋白AKT、ERK1/2、JNK、P38表達水平,評價不同結(jié)構(gòu)納米纖維支架促進BMSC增殖分化的效果,并初步探索不同結(jié)構(gòu)支架材料促進BMSC增殖和誘導(dǎo)分化的機制。通過本研究,我們發(fā)現(xiàn)AYS、AFS和3DPS三種納米纖維材料均具有良好的生物相容性;相對于普通培養(yǎng)法和間歇離心法,生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)法能更好地促進大鼠BMSC長入;不同結(jié)構(gòu)的支架中,BMSC的細胞黏附、增殖、定向分化行為有顯著差異,AYS材料中,BMSC傾向于分化為成纖維細胞,3DPS材料中,BMSC傾向于分化為類軟骨細胞;在不同結(jié)構(gòu)支架中的BMSC的Aggrecan、Sox-9基因表達量也有顯著差異,FAK信號通路相關(guān)蛋白AKT、P38表達水平有顯著差異,提示可能通過Integrin-FAK信號通路發(fā)揮促進增殖和誘導(dǎo)分化的作用。本研究深入研究了AYS、AFS、3DPS三種組織工程支架材料對BMSC行為的影響,并對其促進細胞增殖和定向分化的機制進行了初步研究,有助于進一步優(yōu)化纖維環(huán)組織工程支架產(chǎn)品,推進后續(xù)研究。第一部分納米紗/多孔納米纖維組織工程支架材料生物相容性研究目的:通過體內(nèi)外實驗評價取向納米紗(AYS)、取向納米纖維支架(AFS)、三維多孔納米纖維支架(3DPS)材料的生物相容性。方法:聚乳酸(PLLA)、聚已內(nèi)酯(PCL)和明膠按不同比例配置通過靜電紡絲技術(shù)制備成取向納米紗(AYS)。聚乳酸(PLLA)和明膠混合采用常規(guī)靜電紡絲技術(shù)制作無規(guī)納米纖維,通過改變接收裝置,制備取向納米纖維支架(AFS)。無規(guī)納米纖維再經(jīng)過勻漿/凍干成型制成三維多孔納米纖維支架(3DPS)。將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)接種于上述支架材料。體外培養(yǎng)后檢測細胞在支架材料中黏附、生長情況、增殖、活性,評價體外生物相容性。將三種支架植入大鼠皮下,在不同時間點取材,通過組織學染色、免疫組化、測量囊壁厚度、異物巨細胞的形態(tài)數(shù)目及炎性因子基因表達量,評價體內(nèi)生物相容性。結(jié)果:體外實驗表明骨髓間充質(zhì)干細胞均能在三種材料上黏附、增殖,生長良好。體內(nèi)實驗表明三種材料在體內(nèi)早期(1-2周)均有較輕程度的炎性反應(yīng),4周后炎細胞浸潤減少,異物巨細胞數(shù)量逐漸減少。炎癥因子基因表達量趨勢與炎細胞浸潤相符。結(jié)論:體內(nèi)外實驗結(jié)果證實該支架材料具有良好生物相容性,為進一步開發(fā)纖維環(huán)組織工程支架材料應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。第二部分骨髓間充質(zhì)干細胞在支架材料中長入條件的優(yōu)化目的:對比普通培養(yǎng)法、間歇離心法、生物反應(yīng)器動態(tài)培養(yǎng)法三種不同培養(yǎng)條件下細胞生長存活情況,從而優(yōu)化培養(yǎng)方法。方法:將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)接種于取向納米纖維支架(AFS)、取向納米紗(AYS)、三維多孔納米纖維(3DPS)支架材料,分別采用普通培養(yǎng)方法、間歇離心法以及生物反應(yīng)器動態(tài)培養(yǎng)法進行培養(yǎng)。培養(yǎng)7、14天后,取出支架進行如下檢測:HE染色觀察細胞在支架材料中生長情況;DAPI檢測細胞分布、活性;測量細胞長入深度。結(jié)果:證實生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)法細胞能更好地長入支架材料內(nèi)部,且存活良好。結(jié)論:生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)的動態(tài)培養(yǎng)方法更有利于細胞長入支架內(nèi)部,且細胞存活良好。第三部分不同結(jié)構(gòu)納米纖維支架對骨髓間充質(zhì)干細胞行為的影響及其機制研究目的:比較細胞在不同結(jié)構(gòu)支架材料上的細胞形態(tài)以及黏附、增殖、分化等行為的差異;比較不同支架內(nèi)纖維環(huán)細胞相關(guān)表型分子(COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9)mRNA表達水平以及支架內(nèi)BMSC細胞中FAK信號通路相關(guān)蛋白表達差異。明確支架結(jié)構(gòu)對細胞行為的影響,闡明其可能機制。方法:將前期制備的三種支架材料消毒后備用。在體外將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)接種于三種不同結(jié)構(gòu)支架內(nèi),靜態(tài)培養(yǎng)3周后比較BMSC在三種纖維支架中細胞形態(tài)以及黏附、增殖、分化等行為的差異;提取細胞中cDNA,qRT-PCR測定關(guān)鍵表型分子(COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9)mRNA表達水平。通過Western blot對支架內(nèi)BMSC中相關(guān)蛋白AKT、ERK1/2、JNK、P38含量表達進行檢測。對比不同結(jié)構(gòu)支架對細胞行為的影響。結(jié)果:表明不同結(jié)構(gòu)支架對細胞黏附、增殖、定向分化等細胞行為具有明顯影響,在取向性一致且致密結(jié)構(gòu)的支架內(nèi)細胞形態(tài)類似成纖維細胞,且細胞外基質(zhì)I型膠原含量更高,細胞更易向成纖維細胞方向分化,而在三維多孔不規(guī)則形態(tài)材料中,細胞形態(tài)多呈圓形,且細胞外基質(zhì)II型膠原含量更高,PCR測定Aggrecan、Sox-9基因表達量顯著高于AFS、AYS組,細胞傾向于向類軟骨細胞分化。FAK信號通路相關(guān)蛋白AKT、P38表達水平有顯著差異。結(jié)論:證明不同結(jié)構(gòu)支架形貌可直接影響細胞行為。支架結(jié)構(gòu)調(diào)控細胞行為可能是通過Integrin-FAK信號通路機制發(fā)揮作用。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08
【圖文】：

圖 1 A 為 AFS，B 為 AYS，C 為 3DPS，D 為 3DPS 局部放大圖 標尺為 100um（五）BMSC 的獲取與鑒定取 3 周齡大小的 SD 大鼠，平均體重約 100g，采取頸椎脫臼法處死，75%酒精溶液中浸泡 5min，在無菌條件下取出股骨和脛骨，顯露髓腔，用 DMEM 培養(yǎng)液（低糖）輕柔沖洗骨髓腔，收集骨髓懸液，離心機設(shè)定轉(zhuǎn)速 1000r/min 離心 5min，棄去上清，用 DMEM 洗 2 遍，重新懸浮于 DMEM 培養(yǎng)液中（含 10%胎牛血清）。置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。24h 后更換新鮮培養(yǎng)液。 當原代細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積約 70-80%時，按 1:2 的比例傳代。棄原培養(yǎng)液，PBS 溶液洗滌 2 次。胰蛋白酶消化液消化 2min，待原貼壁的呈纖維狀的細胞逐漸收縮變圓時，立即加入含 10%FBS的 DMEM 終止消化。將貼壁的細胞輕柔吹打成懸液，1000r/min 離心 5min 后收集消化所得的細胞，各取一半分別收集于兩個培養(yǎng)瓶中，加入低糖 DMEM 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），置 37℃，5%CO2 的 CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。取第 3 代 BMSC，胰酶消化，PBS 溶液清洗，離心 5 分鐘（1000 轉(zhuǎn)/min），抽取上清懸液，棄之。離心管底部細胞加入含 3% 胎牛血清的 PBS 溶液，輕輕吹打，

6、囊壁厚度檢測分別于 1、2、4、8 周取出支架，固定切片，HE 染色后，測量包裹支架囊壁厚度，每個時間點每種材料測量 9 個典型視野囊壁厚度。囊壁厚度反映炎癥程度。(八)統(tǒng)計學處理采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析進行處理，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗進行分析處理；不滿足正態(tài)分布和方差齊性時，則采用非參數(shù)檢驗進行分析處理。計數(shù)資料以數(shù)值或百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗進行處理，P<0.05 時認為差異具有統(tǒng)計學意義。三、結(jié)果（一）BMSC 分離及鑒定結(jié)果1、流式細胞儀檢測結(jié)果

圖 3 BMSC 細胞形態(tài)及成骨、成脂分化。A 為 BMSC 形態(tài)；B 為成骨分化；C 為成脂肪分化由圖 3 可見 BMSC 細胞形態(tài)呈長梭形，均一性好。B 圖可見細胞排列為多層，呈鋪路石樣，相互間重疊，細胞內(nèi)部礦化，可見含有大量礦鹽沉積，形成鈣化結(jié)節(jié)。茜素紅染色顯示礦化結(jié)節(jié)呈紅色。具有成骨分化能力。C 圖可見明顯大小不等的脂滴空泡形成，被油紅 O 染成特異性橘紅色，具有成脂分化能力。（二）體外生物相容性1、細胞黏附不同支架上骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）的粘附情況如圖 4。由圖可見共培養(yǎng)2h、4h、8h 和 16h 后，CCK-8 法檢測實驗三組支架 BMSCs 細胞粘附隨時間延長有所增加。與取向納米纖維相比，細胞在取向納米紗及三維多孔納米纖維材料粘附率更高一些；4h 時 AFS 組 OD 值為 1.529±0.02，AYS 組為 1.625±0.04，3DPS 為

【參考文獻】

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1 郭繼東;侯樹勛;李利;史亞民;吳聞文;王華東;商衛(wèi)林;;椎板開窗髓核摘除術(shù)治療腰椎間盤突出癥10年以上隨訪的療效評價[J];中國骨傷;2013年01期

2 侯樹勛,李明全,白巍,商衛(wèi)林,吳聞文,王韜,史亞民,羅卓荊;腰椎髓核摘除術(shù)遠期療效評價[J];中華骨科雜志;2003年09期

本文編號：2803823