【摘要】：第一部分3D打印復(fù)合梯度水凝膠支架的制備及其相關(guān)性能的測試目的:探討利用3D打印技術(shù),制備包含明膠與羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP)的復(fù)合材料梯度水凝膠支架以模擬正常軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)的可行性,并通過相關(guān)檢測了解其結(jié)構(gòu)形態(tài)、力學(xué)性質(zhì)及生物相容性等特征。方法:(1)將A型明膠與甲基丙烯酸酐(Methacrylic Anhydride,MA)通過化學(xué)反應(yīng)合成具有光敏性的甲基丙烯酰胺基明膠(Gelatin Methacrylate,GelMA),并將不同濃度的GelMA與HAP制備成混合溶液;(2)通過紫外光照成形的方法分別制備15%(w/v)GelMA、15%GelMA/3%HAP、30%GelMA、以及30%GelMA/3%HAP四種水凝膠支架;(3)對四種水凝膠支架的溶脹性能、力學(xué)性能、降解性能、及細(xì)胞相容性進(jìn)行檢測比較,根據(jù)結(jié)果選擇最適合梯度支架的材料和濃度配比方案;(4)使用3D打印的方法制備復(fù)合材料梯度水凝膠支架(上層15%GelMA模擬軟骨層,中間層15%GelMA/3%HAP模擬鈣化軟骨層,下層30%GelMA/3%HAP模擬軟骨下骨層)以及其它4種非梯度支架,并對5種支架進(jìn)行機(jī)械性能測試;(5)對梯度支架進(jìn)行掃描電鏡(SEM)觀察,測量其孔徑大小,通過觀察支架表面骨髓間充值干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)粘附情況,測試該支架表面的細(xì)胞相容性;(6)使用qRT-PCR的方法,對BMSCs在梯度復(fù)合支架內(nèi)的成軟骨分化情況進(jìn)行檢測,并與非3D打印組進(jìn)行比較。結(jié)果:(1)GelMA水凝膠的濃度從15%增加到30%時,支架溶脹率下降,兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與15%純GelMA水凝膠相比,添加了3%HAP的混合水凝膠支架的溶脹率降低,兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)GelMA濃度從15%增加到30%時,GelMA水凝膠的楊氏模量明顯上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);15%GelMA在混合了3%HAP后水凝膠的楊氏模量無明顯變化(P0.05);30%GelMA在添加HAP后水凝膠楊氏模量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)30%GelMA降解率低于15%GelMA,同樣濃度的GelMA水凝膠,在混合HAP后,其降解率降低(P0.05)。(4)接種細(xì)胞72h后,15%GelMA水凝膠支架內(nèi)細(xì)胞活性優(yōu)于30%GelMA組(P0.05);在相同濃度的GelMA中混合3%HAP,對于水凝膠的細(xì)胞活性無明顯影響(P0.05)。(5)3D打印復(fù)合梯度水凝膠支架的表面孔徑為397.2±15.6μm;支架具有良好的細(xì)胞相容性,BMSCs可在其表面粘附并生長。(6)壓縮模量測試顯示3D打印復(fù)合梯度水凝膠支架的抗壓縮性能優(yōu)于單純15%GelMA及15%GelMA/3%HAP的非梯度水凝膠支架(P0.05)。(7)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示BMSCs在3D打印復(fù)合梯度支架內(nèi)的成軟骨分化能力優(yōu)于非3D打印組(P0.05),提示復(fù)合梯度支架對于干細(xì)胞的成軟骨分化有一定的促進(jìn)作用。結(jié)論:低濃度GelMA水凝膠支架,具有良好的生物相容性,而隨著濃度的增加,其生物相容性逐漸降低;30%的GelMA水凝膠支架,其溶脹性能、力學(xué)強(qiáng)度均優(yōu)于低濃度(15%)GelMA組;將低濃度的HAP與GelMA混合,不會影響支架的生物相容性;通過3D打印制備的復(fù)合梯度水凝膠支架,能夠較好地模擬正常軟骨的形態(tài)特征,具有良好的生物相容性和力學(xué)特性,優(yōu)于傳統(tǒng)的純GelMA非梯度水凝膠支架,并對接種其內(nèi)部的BMSCs成軟骨分化具有促進(jìn)作用。第二部分3D打印復(fù)合梯度水凝膠支架對軟骨損傷修復(fù)作用的研究目的:通過動物實驗,探討3D打印復(fù)合梯度水凝膠支架對動物軟骨損傷的修復(fù)作用。方法:使用3D打印的方法制備兩種不同的水凝膠支架(分別為:A組為復(fù)合梯度支架:上層15%GelMA、中間層15%GelMA/3%HAP、下層30%GelMA/3%HAP;B組:15%GelMA非梯度水凝膠支架)。選擇18只新西蘭大白兔,隨機(jī)分為3組,在雙膝股骨滑車中央制造直徑3.5mm,深3mm的全層軟骨缺損模型,并將制備的梯度支架與非梯度支架分別植入其中兩組(A、B組)動物的軟骨缺損區(qū)域,C組作為空白對照。術(shù)后第4周、12周每組各處死3只兔子并取材,首先對缺損區(qū)域行大體觀察并采用ICRS評分比較;然后將標(biāo)本制成切片,分別行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)、番紅O、膠原II、固綠-番紅O染色,結(jié)合O’Driscoll組織學(xué)評分對3組動物軟骨損傷的修復(fù)效果進(jìn)行比較。結(jié)果:與B組、C組相比,A組對于全層性軟骨缺損具有更好的修復(fù)效果,其軟骨下骨層修復(fù)組織與宿主組織接合緊密,形態(tài)更相近,部分切片可觀察到軟骨下骨層已基本愈合,并有鈣化軟骨層形成,但部分切片軟骨修復(fù)表面仍有少量凹陷或高于周圍軟骨面。A組ICRS和O’Driscoll組織學(xué)評分在4周和12周時均優(yōu)于其它2組(P0.05);B組在12周時兩項評分均優(yōu)于C組(P0.05)。結(jié)論:3D打印復(fù)合梯度支架在實驗動物體內(nèi)表現(xiàn)出了良好的生物相容性和可降解性;該支架可以通過原位壓配的方式植入,實驗結(jié)果證實其與軟骨缺損處達(dá)到較緊密的結(jié)合,不易脫落;本次實驗所設(shè)計的3D打印復(fù)合梯度水凝膠支架,具有較好的促進(jìn)軟骨修復(fù)和軟骨下骨形成的作用。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08
【圖文】：

3D 打印復(fù)合梯度水凝膠支架的制備及其對軟絡(luò)中，嵌入了由蛋白多糖和糖蛋白的凝膠樣結(jié)構(gòu)，從[11]。據(jù)其形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)組成的差異，可分為四個區(qū)域，骨深層和鈣化軟骨層[12]。如圖 1.1 所示，每個區(qū)域均每個區(qū)域內(nèi) ECM 組成成分和比例的不同，使軟骨各所差異。

圖 2.2 拉伸實驗圖及啞鈴形拉伸試樣圖將制備的樣品放置于力學(xué)試驗機(jī) ElectroForce（TA Instruments, 美國）上進(jìn)行單軸拉伸試驗，拉伸速率設(shè)置為 1mm/mim，拉伸的初始長度為 5 mm，拉伸過程中詳細(xì)并記錄實驗數(shù)據(jù)。在拉伸曲線的 0-10%的形變處取斜率，得到樣品的楊氏模量。每組設(shè)置 6 個平行樣本。6、水凝膠降解性能測試方法①將上文所述的四組水凝膠制備成圓柱樣品（厚 4 mm，直徑 12 mm）；②所有樣品凍干后稱重，得到初始重量 Wi 并記錄；③使用 PBS 溶液將凍干后的樣品浸沒 24 小時使其充分溶脹，之后加入濃度為 2.5U/mL 的Ⅱ型膠原酶 2 mL，并將其置于轉(zhuǎn)速為 130 轉(zhuǎn)/分、溫度為 37 ℃的恒溫?fù)u床中震蕩；

-33-c d圖 2.6 0h 細(xì)胞在各組水凝膠內(nèi)細(xì)胞生長情況（從 a-d 依次為 15、15+3、30、30+3，圖片標(biāo)尺為 100μm（參照 d））圖:2.7 是水凝膠固化后 72h 時細(xì)胞的活性染色圖，從圖上可以看出 30 和 30+3 組死亡細(xì)胞數(shù)量較 0h 時明顯增多，而 15 和 15+3 的水凝膠內(nèi)部的死細(xì)胞數(shù)量與 0h 時無明顯變化。除此之外，我們可以發(fā)現(xiàn) 15%、30%的 GelMA 與其對應(yīng)濃度添加混合3%HAP 的水凝膠相比，其死亡細(xì)胞數(shù)量大體相當(dāng)。據(jù)此，我們推測納米 HAP 的加入對于復(fù)合水凝膠的細(xì)胞相容性無明顯影響。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2798750