【摘要】：對于生物分子的檢測一直以來都是生物醫(yī)學工程學科的一項重要課題。金屬卟啉是一種共軛有機金屬配合物,它能夠模擬很多種酶的活性中心,在催化研究領(lǐng)域有著廣泛的應用前景。本文通過結(jié)合點擊化學技術(shù),使用卟啉類化合物催化了原子自由基聚合(ATRP)反應進行了電化學信號放大,并應用于凝血酶蛋白分子的生物傳感。1.本實驗中,首先使用兩段核酸適配體包夾凝血酶,將待測的凝血酶固定在金電極表面,再通過點擊化學的方法,被抗壞血酸還原為一價的銅離子催化了疊氮-炔基的環(huán)加成反應,即能將ATRP引發(fā)劑連接在核酸適配體末端。隨后,在體系中引入ATRP反應,使用了氯化鐵卟啉(Hemin)進行催化,使得帶有二茂鐵的ATRP反應單體聚合為長鏈,進行了信號放大,即可進行對凝血酶的高靈敏度檢測。實驗表明,該反應可對凝血酶進行低至0.12 fM濃度的檢測,與傳統(tǒng)凝血酶檢測方法相比提高了約三個數(shù)量級以上。2.本實驗使用同樣的方法將凝血酶固定在金電極表面,通過電化學還原硫酸銅的方法得到了一價銅離子進行點擊化學的催化,在ATRP反應中使用了錳卟啉化合物進行催化,構(gòu)建了更高靈敏度的凝血酶傳感器,檢測限和線性檢測范圍分別達到了 0.08 fM和10-14～10-9 M。同時對實驗條件的優(yōu)化表明,該檢測過程操作簡單,成本低,時間較短,在稀釋血清樣品中也能表現(xiàn)出很好的抗干擾能力,說明這種檢測方法在生物分析、臨床診斷等領(lǐng)域具有很大的潛在應用。
【學位授予單位】：南京理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318
【圖文】：

，速、操作十分簡便且檢測性能高。逡逑第一代酶生物傳感器使用酶與電極間的電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)主要為氧氣或過氧化氫，產(chǎn)生逡逑電流大小和氧氣濃度呈一定比例關(guān)系，從而推出待測物濃度。它的不足主要是檢測環(huán)境逡逑的氣密性較難保證，氧氣作為氧化還原指示劑時需要較高的氧化還原電位（０．７Ｖ左右），逡逑而高電位易使某些雜質(zhì)顯示出催化作用來干擾實驗［８］。逡逑為了不影響生物傳感器檢測的特異性，人們尋找了一些電活性的小分子作電子轉(zhuǎn)移逡逑介質(zhì)。電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)能在低電位時把電子從酶活性中心傳遞到電極表面，促進酶的氧化逡逑還原活性中心和電極間的電子耦合而產(chǎn)生響應，從而引起電流的變化。這就是第二代酶逡逑生物傳感器。常用的電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)包括了二茂鐵及其衍生物［９］，普魯士藍［１（）］，亞甲基藍逡逑［１１］，硫堇［１２］等。然而，電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)傳遞電子的過程不是特異性的，酶與電極界面間的逡逑介體有擴散屏障，這使得二者之間不能發(fā)生直接的電子轉(zhuǎn)移。逡逑第三代電化學酶傳感器目前最具優(yōu)勢，它可直接使得固定酶的活性中心與電極表面逡逑間的電子不通過電活性物質(zhì)的傳遞而發(fā)生迅速轉(zhuǎn)移，整個反應過程增加了電極的靈敏度逡逑及響應速度。三代生物傳感器的示意圖如圖１．１［１３］。逡逑（Ａ）邐（Ｂ）邐（Ｃ）逡逑

解離常數(shù)甚至可以達到皮摩爾（ｐＭ）級［５７］。不同靶分子與適配體進行特異逡逑性識別時，構(gòu)建模式主要有（ａ）包埋型，（ｂ）單位點結(jié)合型，（ｃ）雙位點結(jié)合型和（ｄ）逡逑復合夾心型［５８］，如圖１．４。小分子的分子量較小，因此核酸適配體可將其包埋在立體空逡逑間結(jié)構(gòu)內(nèi)（ａ）；大分子結(jié)構(gòu)較復雜，核酸適配體可能會通過分子間作用力、氫鍵或堆疊逡逑等方式與其結(jié)合，并分為單個位點（ｂ）和雙位點（ｃ）的結(jié)合。雙位點結(jié)合發(fā)生時，會逡逑存在兩條適配體，通常一條作為捕獲探針固定于電極、納米粒子或芯片等載體表面，另逡逑一條一般與熒光材料或有電化學信號的材料等修飾基團相連，作為帶信號的探針；還有逡逑一種引入抗體的結(jié)合方式，再將靶分子置于夾心中（ｄ），實現(xiàn)對靶物質(zhì)的測定。逡逑１．３．１核酸適配體在檢測蛋白質(zhì)中的應用逡逑核酸適配體具有與靶物質(zhì)結(jié)合選擇性高、特異性強、篩選周期短、穩(wěn)定性強等等優(yōu)逡逑點，已被廣泛應用于生物傳感器研宄領(lǐng)域，特別是檢測蛋白質(zhì)方面。目前已開發(fā)出多種逡逑７逡逑

的單體小分子，能夠形成含有上千個重復單元的高分子鏈，即通過高分子鏈的增長把單逡逑個生物分子的識別過程放大幾千倍，從而實現(xiàn)了對生物檢測信號的高效放大，原理示意逡逑圖如圖１．６。通常的ＡＴＲＰ方法具有以下特點：在反應初期時體系中的引發(fā)劑就應該被逡逑消耗完并生成增長的鏈，且每一步參與反應的單體數(shù)很小，鏈轉(zhuǎn)移和鏈終止的反應在整逡逑個反應體系中是可以被忽略的。逡逑９逡逑

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本文編號：2797203