【摘要】：目的:探討不同濃度(1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.125%)RADA16-I多肽自組裝水凝膠支架對(duì)人牙髓細(xì)胞(human dental pulp cells,hDPCs)和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)生長(zhǎng)和增殖能力的影響,探索最佳水凝膠濃度。利用RADA16-I水凝膠構(gòu)建三維培養(yǎng)環(huán)境,將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和人牙髓細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),評(píng)估牙髓細(xì)胞對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的牙向誘導(dǎo)分化作用,為后續(xù)的相關(guān)研究建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:實(shí)驗(yàn)一水凝膠中三維培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞增殖的影響:選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4~6代hDPCs、hUCMSCs與水凝膠混合制備水凝膠-細(xì)胞復(fù)合體;倒置相差顯微鏡下拍片并記錄各組細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài);分別于培養(yǎng)第3、6、9、12天采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀況,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。綜合分析,確定適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳水凝膠濃度。實(shí)驗(yàn)二hUCMSCs、經(jīng)BMP-2誘導(dǎo)成牙分化后的hDPCs、BMP-2以及水凝膠構(gòu)建三維共培養(yǎng)體系:分為hDPCs組、hUCMSCs與hDPCs共培養(yǎng)組、hUCMSCs組。培養(yǎng)第1、3、6、9、12天,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;培養(yǎng)第7、14天檢測(cè)各組ALP活性,提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)成牙本質(zhì)相關(guān)基因DSPP、DMP-1、ALP、OCN mRNA的表達(dá)情況;培養(yǎng)第21天后行茜素紅染色,檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)形成情況。結(jié)果:細(xì)胞在水凝膠中三維培養(yǎng)呈團(tuán)狀生長(zhǎng),而二維培養(yǎng)組呈扁平梭形生長(zhǎng),為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。MTT結(jié)果顯示:(1)二維培養(yǎng)細(xì)胞在3~6天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,6天后進(jìn)入平臺(tái)期。(2)hUCMSCs和hDPCs都能在水凝膠中穩(wěn)定生長(zhǎng):hUCMSCs在水凝膠中經(jīng)過幾天的潛伏適應(yīng)期,第6~9天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;而hDPCs對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為第3~6天,6天后增殖速度減緩。(3)間充質(zhì)干細(xì)胞能在水凝膠支架中正常生長(zhǎng)和增殖,低濃度水凝膠中hUCMSCs和hDPCs的增殖能力較高濃度者更強(qiáng)(P0.05)。綜合考慮細(xì)胞相容性及水凝膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,我們選擇0.25%的水凝膠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。水凝膠中三維共培養(yǎng)組的細(xì)胞增殖活性、ALP活性及礦化結(jié)節(jié)生成能力均高于兩種細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)組(P0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示,共培養(yǎng)組在基因(DSPP、DMP-1、ALP、OCN)mRNA的表達(dá)高于hUCMSCs組,接近于hDPCs單獨(dú)培養(yǎng)組,某些時(shí)刻甚至超過hDPCs單獨(dú)培養(yǎng)組。結(jié)論:RADA16-I水凝膠具備良好的生物相容性,綜合評(píng)價(jià)篩選出濃度為0.25%的水凝膠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。水凝膠與1:1混合的hDPCs、hUCMSCs構(gòu)建的水凝膠-細(xì)胞復(fù)合體能在BMP-2誘導(dǎo)的環(huán)境下,保持良好的生長(zhǎng)和分化,牙向分化和礦化能力甚至超過同等生長(zhǎng)環(huán)境的hDPCs單獨(dú)培養(yǎng)組,說明共培養(yǎng)系統(tǒng)中,細(xì)胞的增殖與分化受到某種程度上的調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R783.1
【圖文】：

A B圖 1-1細(xì)胞形態(tài)（×40）A：hDPCs；B：hUCMSCsFig. 1-1 Morphology of hDPCs (A) and hUCMSCs (B) （×40）.2 水凝膠及細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察肉眼觀察：未成膠的水凝膠，無色透明，高濃度者粘稠如膠凍狀，

G H I J K L圖 1-2 hUCMSCs 在不同濃度 RADA16-I 水凝膠中的生長(zhǎng)（×40）A- F、G-L 分別為第 9 天各組（0%、0.125%、0.25%、0.5%、0.75%、1%組）加 MTT 前、后Fig.1-2 hUCMSCs cultured in RADA16-I of different concentrations(0%、0.125%、0.25%、0.5%、0.75%、1%) on day9 (A- F); MTT staining of viable cells (G-L)（×40）

圖 1-3 hUCMSCs 和 hDPCs 在不同濃度水凝膠中的增殖狀態(tài)注：A 、B 分別為 hUCMSCs、hDPCs 的生長(zhǎng)曲線Fig. 1-3 hUCMSCs and hDPCs cultured in hydrogels of different concentrations respectivelyA: Growth curve of hUCMSCs; B: Growth curve of hDPCs.

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本文編號(hào)：2791406