【摘要】：齲病、外傷、牙周病等均可能導(dǎo)致牙齒的缺損或缺失,牙齒自我修復(fù)缺損的能力非常有限,目前牙齒缺損修復(fù)方法雖然較多,但均存在著各種不足。組織工程技術(shù)利用干細(xì)胞多向分化潛能的特性,復(fù)合支架材料修復(fù)缺損組織和器官,是再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。課題組在前期的實(shí)驗(yàn)研究中成功制備出了機(jī)械強(qiáng)度高,孔隙率大小合適的三維聯(lián)通納米氧化鋯支架,可以作為組織缺損修復(fù)的支架材料。但是前期在支架制備的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)支架首次燒結(jié)成型率有待提高。氧化鋯雖然具有良好的生物相容性和機(jī)械性能,但是其與細(xì)胞和組織親和力欠佳。RGD多肽是由3個(gè)氨基酸構(gòu)成的短肽,可以促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化。人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)是位于牙髓組織中的一種間充質(zhì)干細(xì)胞,在一定的誘導(dǎo)環(huán)境下具有多向分化能力,并具有來(lái)源廣泛、取材方便等優(yōu)點(diǎn)。hDPSCs的成牙本質(zhì)向分化是牙齒生長(zhǎng)發(fā)育和牙髓組織損傷修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,其過(guò)程受多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路調(diào)控,具體機(jī)制尚未完全明了。LIM礦化蛋白-1(LMP-1)是一種具有成骨誘導(dǎo)活性的細(xì)胞內(nèi)非分泌蛋白,在礦化過(guò)程中起正向調(diào)節(jié)作用,大量研究表明LMP-1在生長(zhǎng)發(fā)育和受外界刺激牙齒的牙髓組織、成牙本質(zhì)細(xì)胞及修復(fù)性牙本質(zhì)中有著不同程度的表達(dá),但是其在hDPSCs成牙本質(zhì)方向分化過(guò)程中的作用和機(jī)制目前尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道。本研究旨在通過(guò)改進(jìn)氧化鋯支架燒結(jié)工藝,表面修飾改性,進(jìn)一步完善支架的載體性能。探討LMP-1在hDPSCs成牙本質(zhì)方向分化過(guò)程中的作用,為hDPSCs成牙本質(zhì)方向分化提供新的思路和方法,初步觀察復(fù)合RGD多肽的氧化鋯支架對(duì)LMP-1過(guò)表達(dá)hDPSCs黏附、增殖和分化的影響,探討其對(duì)牙齒缺損修復(fù)及應(yīng)用到組織工程的可行性。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果:1、三維聯(lián)通納米氧化鋯支架性能優(yōu)化本研究通過(guò)延長(zhǎng)支架燒結(jié)過(guò)程中1360℃到1060℃冷卻時(shí)間,發(fā)現(xiàn)隨著冷卻時(shí)間的不斷延長(zhǎng),支架燒結(jié)成型率明顯提高。且SEM觀察隨著冷卻時(shí)間的延長(zhǎng),支架梁柱上的裂紋數(shù)量和長(zhǎng)度明顯減少;通過(guò)對(duì)支架進(jìn)行Micro-CT掃描重建和壓縮強(qiáng)度測(cè)試,發(fā)現(xiàn)冷卻時(shí)間超過(guò)8h后,支架的平均小梁數(shù)目和小梁平均厚度以及壓縮強(qiáng)度顯著高于其他組。通過(guò)FTIR分析RGD多肽能夠通過(guò)共價(jià)鍵良好固定在支架表面,CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)通過(guò)RGD修飾能促進(jìn)細(xì)胞在支架上的初期黏附。2、hDPSCs的分離、純化、培養(yǎng)與鑒定本實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織塊結(jié)合酶消化法從人牙髓組織中分離培養(yǎng)出原代細(xì)胞,再經(jīng)有限稀釋法挑選單克隆進(jìn)行細(xì)胞純化和傳代擴(kuò)大培養(yǎng),通過(guò)克隆形成能力檢測(cè)細(xì)胞具有較強(qiáng)克隆集落形成能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物,陰性表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)記物;經(jīng)成骨/成牙本質(zhì)方向誘導(dǎo)分化和成脂方向誘導(dǎo)分化后染色均呈陽(yáng)性。證明成功分離培養(yǎng)出了hDPSCs。3、LMP-1對(duì)hDPSCs增殖和分化能力的影響本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,能夠高效感染hDPSCs,穩(wěn)定沉默和過(guò)表達(dá)hDPSCs中LMP-1,通過(guò)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力,發(fā)現(xiàn)LMP-1基因沉默和過(guò)表達(dá)對(duì)hDPSCs的增殖能力無(wú)明顯影響;沉默hDPSCs中LMP-1表達(dá),細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成能力明顯減弱,通過(guò)qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ALP、DSPP、DMP-1的mRNA和蛋白的表達(dá)也不同程度降低;而過(guò)表達(dá)LMP-1后,細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成能力增強(qiáng),ALP、DSPP、DMP-1的mRNA和蛋白表達(dá)也顯著增加。4、三維聯(lián)通納米氧化鋯支架附著LMP-1過(guò)表達(dá)hDPSCs的體外研究本研究將前期性能優(yōu)化的支架作為載體,附著LMP-1過(guò)表達(dá)的hDPSCs培養(yǎng),觀察細(xì)胞能夠在支架上良好的黏附和增殖;通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)100mg/L的RGD多肽能更好的促進(jìn)細(xì)胞在氧化鋯支架上的黏附和增殖。通過(guò)ALP活性檢測(cè),觀察到復(fù)合RGD多肽的納米氧化鋯支架對(duì)LMP-1過(guò)表達(dá)hDPSCs的成骨/成牙本質(zhì)方向分化有協(xié)同作用。綜上所述,本研究通過(guò)改進(jìn)支架燒結(jié)流程,延長(zhǎng)冷卻時(shí)間,明顯改善了支架燒結(jié)的首次成型率,且提高了支架強(qiáng)度;使用RGD多肽修飾支架后增加了支架的親水性,提高了支架的細(xì)胞初期黏附能力;成功分離鑒定培養(yǎng)出了hDPSCs,沉默或過(guò)表達(dá)hDPSCs中LMP-1的表達(dá),對(duì)細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯影響,LMP-1沉默可抑制hDPSCs的成牙本質(zhì)方向分化,而過(guò)表達(dá)LMP-1可促進(jìn)hDPSCs的成牙本質(zhì)方向分化;100mg/L的RGD多肽修飾的支架能促進(jìn)LMP-1過(guò)表達(dá)hDPSCs的黏附、增殖和分化,為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行提供了有效基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R783.1
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文孔三維聯(lián)通空間結(jié)構(gòu)。在對(duì)照組（冷卻時(shí)間 1h）中，燒結(jié)出的支架周?chē)梢?jiàn)落的氧化鋯支架顆粒，時(shí)有支架整體結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)斷裂、坍塌等情況；隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，支架周?chē)撀漕w粒明顯減少，在冷卻時(shí)間≥8h 組均未見(jiàn)明顯脫顆粒，且各實(shí)驗(yàn)組中均未見(jiàn)到支架整體結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象（圖 1.1）。

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文孔三維聯(lián)通空間結(jié)構(gòu)。在對(duì)照組（冷卻時(shí)間 1h）中，燒結(jié)出的支架周?chē)梢?jiàn)落的氧化鋯支架顆粒，時(shí)有支架整體結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)斷裂、坍塌等情況；隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，支架周?chē)撀漕w粒明顯減少，在冷卻時(shí)間≥8h 組均未見(jiàn)明顯脫顆粒，且各實(shí)驗(yàn)組中均未見(jiàn)到支架整體結(jié)構(gòu)破壞現(xiàn)象（圖 1.1）。

-24-圖 1.2 不同冷卻時(shí)間納米氧化鋯支架 SEM 觀察.3 納米氧化鋯支架 Micro-CT 掃描通過(guò)對(duì)支架進(jìn)行 Micro-CT 掃描重建，我們可以清楚看到支架之間具有良好隙結(jié)構(gòu)，支架孔隙率高，孔徑大小在 600-800μm 之間（圖 1.3A）。Micro-CT 分析顯示冷卻時(shí)間≥8h 的實(shí)驗(yàn)組平均小梁數(shù)量顯著高于對(duì)照組（5），組間無(wú)明顯差異（p＞0.05）（圖 1.3B）；小梁平均厚度分析顯示：冷卻 6h 組以及≥8h 組的小梁平均厚度都明顯高于對(duì)照組（分別為 p＜0.05，p＜0卻時(shí)間 4h 和 6h 組之間，8h、10h、12h 組間無(wú)明顯差異（p＞0.05）（圖 1.

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙婷;王鋼;齊嘉豪;武越;孫曉敏;;納米氧化鋯的制備和表征[J];化工設(shè)計(jì)通訊;2018年12期

2 彭偉校;王開(kāi)軍;胡勁;王玉天;孫鴻鵬;易峰;;純/摻雜納米氧化鋯粉體水熱法制備研究進(jìn)展[J];材料導(dǎo)報(bào);2013年19期

3 范增為;喻善軍;王瑞生;;納米氧化鋯粉體的制備[J];陶瓷;2007年04期

4 祝威,王少君,趙玉軍,王紅麗,楊婉;納米氧化鋯的制備及其在催化領(lǐng)域中的應(yīng)用[J];遼寧化工;2005年10期

5 陳文,張存林,楊小怡;表面修飾納米氧化鋯的制備與表征[J];首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年02期

6 寧寧;我國(guó)開(kāi)發(fā)納米氧化鋯粉體制備新工藝[J];稀土信息;2002年02期

7 毛志強(qiáng);李志印;王勇;;納米氧化鋯材料等離子噴涂涂層性能研究及應(yīng)用[J];中國(guó)艦船研究;2010年03期

8 賈虎生;納米氧化鋯粉體包碳修飾研究[J];材料熱處理學(xué)報(bào);2005年03期

9 孫家躍,肖昂,夏志國(guó),杜海燕;均相沉淀-發(fā)泡法制備納米氧化鋯材料的研究[J];化工新型材料;2005年07期

10 ;中國(guó)地質(zhì)大學(xué)研制出納米氧化鋯粉體[J];有色冶金節(jié)能;2002年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 連加松;;納米氧化鋯粉體的制備[A];94'全國(guó)結(jié)構(gòu)陶瓷、功能陶瓷、金屬/陶瓷封接學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];1994年

2 柳彥博;王全勝;馬壯;李東榮;;納米氧化鋯熱障涂層制備工藝對(duì)導(dǎo)熱性能影響的研究[A];第十五屆全國(guó)高技術(shù)陶瓷學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集[C];2008年

3 黎維彬;楊絮飛;;氮氧化物在納米氧化鋯上的吸附研究[A];納米材料和技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展——全國(guó)第二屆納米材料和技術(shù)應(yīng)用會(huì)議論文集（上卷）[C];2001年

4 史麗英;王英;;高比表面積納米氧化鋯的制備及應(yīng)用[A];第五屆中國(guó)功能材料及其應(yīng)用學(xué)術(shù)會(huì)議論文集Ⅱ[C];2004年

5 張曉蕓;閆翠芬;李小莉;賈虎生;許并社;;表面包裹碳膜的納米氧化鋯粉體的燒結(jié)[A];第十三屆全國(guó)電子顯微學(xué)會(huì)議論文集[C];2004年

6 趙永旗;蔣麗;李偉;廖運(yùn)茂;;牙科著色納米氧化鋯的制備[A];第十二次全國(guó)口腔材料學(xué)術(shù)會(huì)第五屆口腔材料專(zhuān)委會(huì)換屆會(huì)議論文集[C];2017年

7 李靜;沈洋;林元華;;晶型誘導(dǎo)劑對(duì)納米氧化鋯晶相及其光學(xué)性能的影響[A];第十七屆全國(guó)高技術(shù)陶瓷學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集[C];2012年

8 段國(guó)榮;劉孝恒;楊緒杰;陸路德;汪信;;溶膠-凝膠法制備納米氧化鋯及其相變機(jī)理研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第九屆全國(guó)應(yīng)用化學(xué)年會(huì)論文集[C];2005年

9 劉揚(yáng)帆;趙婉瑜;白中義;郭曉琴;張銳;;微波燒結(jié)溫度對(duì)合成納米氧化鋯鏈狀纖維的影響[A];第十九屆全國(guó)高技術(shù)陶瓷學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集[C];2016年

10 李文旭;王福平;姜兆華;;納米氧化鋯與纖維鈦酸鋇復(fù)合燒結(jié)體性能的研究[A];納米材料和技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展——全國(guó)第二屆納米材料和技術(shù)應(yīng)用會(huì)議論文集（上卷）[C];2001年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前6條

1 鐘體;中國(guó)地質(zhì)大學(xué)研制出納米氧化鋯粉體[N];中國(guó)有色金屬報(bào);2002年

2 劉曙甲 劉志偉;我國(guó)成功開(kāi)發(fā)納米氧化鋯粉體制備新工藝[N];科技日?qǐng)?bào);2001年

3 張凌 董芝會(huì);自主研發(fā)闖新路[N];中國(guó)航空?qǐng)?bào);2006年

4 記者 吉明亮 報(bào)道組 周長(zhǎng)春 王寅鋒;蘭溪引大項(xiàng)目撐起穩(wěn)健發(fā)展脊梁[N];金華日?qǐng)?bào);2014年

5 武文霞;市長(zhǎng)點(diǎn)評(píng)企業(yè)創(chuàng)新[N];焦作日?qǐng)?bào);2006年

6 國(guó)海證券 王安田;韶能股份：低價(jià)電力股 “紅三兵”助漲[N];中國(guó)證券報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 常鷹;球形納米氧化鋯粉末及其涂層材料的研究[D];中南大學(xué);2006年

2 吳建鋒;化療藥物納米囊復(fù)合納米氧化鋯/磷酸鈣支架骨重建及藥物控釋系統(tǒng)的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2009年

3 呂曉棠;納米級(jí)氧化鋯功能材料的制備及性能研究[D];吉林大學(xué);2010年

4 杜長(zhǎng)星;爆炸壓涂制備功能涂層及其機(jī)理研究[D];南京理工大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 朱磊;三維聯(lián)通納米氧化鋯支架改性及附著LMP-1過(guò)表達(dá)hDPSCs的研究[D];中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

2 許冉冉;成型工藝對(duì)納米氧化鋯材料機(jī)械性能的影響[D];華北理工大學(xué);2018年

3 劉更伯;經(jīng)靜脈途徑納米氧化鋯顆粒對(duì)大鼠脾臟的毒性研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

4 杜寬河;等離子噴涂用納米氧化鋯團(tuán)聚粉末的制備研究[D];湖北工業(yè)大學(xué);2012年

5 石贊;四方納米氧化鋯制備工藝研究和定量分析[D];湖北工業(yè)大學(xué);2010年

6 白玖紅;納米氧化鋯復(fù)合陶瓷涂層的耐高溫性能研究[D];內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué);2010年

7 郭美畫(huà);等離子噴涂納米氧化鋯—鈦基臺(tái)材料的機(jī)械相容性研究[D];山東大學(xué);2015年

8 王祝;納米氧化鋯復(fù)合水泥基材料制備、性能與機(jī)理[D];大連理工大學(xué);2017年

9 王海博;納米氧化鋯電極的制備及其對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

10 孫向濤;電化學(xué)沉淀法制備納米氧化鋯和鈦酸鹽粉體的研究[D];新疆大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2791054