【摘要】：聚多巴胺模板化羥基磷灰石(polydopamine-templated hydroxyapatite,tHA)是一種以多巴胺為模板,仿生合成晶體結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石生物材料,其晶體形態(tài)和化學(xué)組分與天然骨組織的微觀結(jié)構(gòu)接近,具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨組織缺損修復(fù)再生的效應(yīng)。將tHA作為支架材料應(yīng)用于牙周骨組織工程領(lǐng)域,具有巨大的研究價值。然而,研究發(fā)現(xiàn)高濃度的tHA會引起細(xì)胞內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species,ROS)增高,ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致細(xì)胞活性和成骨能力降低。因此,提升tHA材料的生物相容性、防止氧化應(yīng)激損傷、提高細(xì)胞活性和成骨能力是該材料在牙周組織工程應(yīng)用中亟待解決的問題。據(jù)報道,治療II型糖尿病的首選藥二甲雙胍(metformin,MET)具有抵抗氧化損傷、防止細(xì)胞衰老和凋亡的作用,這種作用可能與腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphateactivated protein kinase,AMPK)信號通路誘導(dǎo)的自噬密切相關(guān)。自噬是細(xì)胞應(yīng)對損傷、炎癥、衰老的重要保護(hù)機(jī)制,細(xì)胞通過自噬能夠清除過量的ROS以及被ROS損傷的細(xì)胞器和蛋白質(zhì),降低ROS對細(xì)胞的損傷,維持細(xì)胞正常的生理功能。此外,還有研究報導(dǎo)MET具有潛在的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和增加礦化結(jié)節(jié)形成,以及輔助控制牙周炎癥的作用。本研究將MET與tHA材料結(jié)合用于牙周組織工程研究,通過體外和體內(nèi)實驗,探討是否能夠利用MET促進(jìn)自噬,提高牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs)在tHA材料上的活性,并進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞成骨分化和牙周骨組織修復(fù)再生。首先,本研究采用仿生法合成了tHA材料并對其進(jìn)行理化性質(zhì)表征。體外實驗部分:用tHA聯(lián)合MET培養(yǎng)h PDLSCs。通過檢測細(xì)胞內(nèi)ROS、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放、細(xì)胞凋亡周期、細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞骨架染色評估細(xì)胞活性和材料生物相容性。通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性測定、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色、骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)基因表達(dá),評估牙周膜干細(xì)胞在tHA聯(lián)合MET條件下的成骨分化效應(yīng)。通過免疫印跡法(western blot,WB)分析自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1和LC3表達(dá),以及AMPK/m TOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的磷酸化,闡明tHA聯(lián)合MET誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞自噬的機(jī)制。研究結(jié)果顯示tHA聯(lián)合MET顯著減少h PDLSCs細(xì)胞內(nèi)ROS積累,減少LDH釋放,降低細(xì)胞凋亡和死亡率,提高細(xì)胞增殖活性,增強(qiáng)細(xì)胞骨架伸展和粘附。tHA聯(lián)合MET明顯提高h(yuǎn) PDLSCs的ALP活性,增加礦化結(jié)節(jié)形成和成骨基因OCN、OPN和RUNX2的表達(dá)。tHA聯(lián)合MET增強(qiáng)了自噬蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ的表達(dá),并且激活A(yù)MPK通路,同時抑制m TOR信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。體內(nèi)實驗部分:建立SD大鼠下頜第一磨牙根方牙槽骨缺損模型,骨缺損處植入tHA與MET復(fù)合物,10周后收集樣本,通過Micro CT進(jìn)行術(shù)區(qū)骨組織三維掃描重建,通過鈣黃綠素和茜素紅熒光標(biāo)記新骨形成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)tHA聯(lián)合MET能夠有效促進(jìn)缺損處新骨形成,提高骨組織礦化速度,對牙周骨組織缺損有顯著的修復(fù)再生效應(yīng)。綜上所述,本研究結(jié)果表明MET能夠改善tHA材料生物相容性,提高h(yuǎn) PDLSCs在tHA材料上的活性,并協(xié)同促進(jìn)成骨分化效應(yīng)。tHA生物相容性的提高可能與MET經(jīng)AMPK/m TOR信號途徑誘導(dǎo)的自噬密切相關(guān)。此外,tHA聯(lián)合MET在體內(nèi)對大鼠牙周骨組織缺損有明顯的修復(fù)再生作用。因此,tHA聯(lián)合MET在牙周骨組織修復(fù)再生領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R783.1
【圖文】：

14圖 1-2.3 tHA 生物材料的制備Figure 1-2.3 tHA synthesis：A 合成示意圖；B 合成 tHA 操作過程2.4 tHA 材料理化性質(zhì)表征2.4.1 TEM 觀察將 tHA 粉末和一種傳統(tǒng)的商品化羥基磷灰石 HA 進(jìn)行 TEM 表征和對比。使用JEM-1400PLUS（JEOL，Tokyo，Japan）透射電子顯微鏡（TEM）觀察兩種納米羥基磷灰石的形態(tài)。分別將 tHA 和傳統(tǒng) HA 粉末分散在乙醇溶液中，并超聲分離。將懸液滴加到碳涂覆的銅網(wǎng)上，待干燥后在 TEM 下成像。使用 ImageJ 軟件對 tHA

圖像進(jìn)行尺寸分析。2.4.2 XPS 分析使用 ESCALAB250XiX 射線光電子能譜儀（XPS）微探針分析 tHA 和傳統(tǒng) HA學(xué)元素組成。使用 Origin（OriginLab，Northampton，MA，USA）進(jìn)行元素定析。果 tHA 材料晶體形態(tài)觀察結(jié)果如圖 1-3.1 所示，TEM 鏡下見 tHA 晶體聚集成簇，呈現(xiàn)出海綿狀結(jié)構(gòu)（圖 1）；傳統(tǒng) HA 晶體呈棒狀結(jié)構(gòu)，未見明顯聚集（圖 1-3.1B）。通過 Image J 軟件 tHA 直徑為 18.22±2.79nm，長度為 102.78±9.68nm。

圖 1-3.2 tHA 與傳統(tǒng) HA 化學(xué)元素 XPS 分析Figure 1-3.2 XPS analysis of tHA and traditional HA nanoparticles：A：寬光譜分析；B：高分辨率氮光譜分析4 討論傳統(tǒng)的 HA 通過化學(xué)沉淀或水熱法等常規(guī)方法合成，這些方法需要苛刻的反應(yīng)條件，如極高的溫度或極端的 pH 值等，合成過程易產(chǎn)生有害物質(zhì)[20]。此外，傳統(tǒng) HA 晶體的尺寸、形態(tài)和結(jié)晶度也與天然骨中 HA 晶體存在較大的差異。本研究合成的 tHA 利用 PDA 中的兒茶酚胺官能團(tuán)螯合鈣離子，并吸附磷酸根離子與氫氧根離子形成晶體成核中心，并不斷沉積生長形成海綿狀的最終的晶體形態(tài)。這種仿生合成法模擬天然骨組織中羥基磷灰石的生長發(fā)生過程，調(diào)控晶體礦化和生長方向，其形態(tài)結(jié)構(gòu)更接近于天然骨中的羥基磷灰石[16][36]。[18]

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李治邦;高麗娜;畢春升;陳發(fā)明;;牙周組織再生的臨床研究進(jìn)展[J];實用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2015年06期

本文編號：2786270