【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種全球性多發(fā)性疾病,其關(guān)節(jié)置換手術(shù)的比例逐年上升。RA傳統(tǒng)假體雖然可以實現(xiàn)早期臨時固定,但是無法形成良好的界面骨整合,從而影響假體的長期穩(wěn)定性。因此,我們需要針對RA的發(fā)病機制和病理基礎(chǔ),研發(fā)具有生物活性界面的人工關(guān)節(jié)假體,對解決RA假體松動高發(fā)的難題具有重要的臨床意義。研究表明RA術(shù)后假體松動主要與傳統(tǒng)假體設(shè)計和周圍炎癥水平有關(guān)。傳統(tǒng)鈦合金內(nèi)植物與宿主骨之間的彈性模量不匹配,易產(chǎn)生應(yīng)力遮擋效應(yīng)。目前電子束熔融(electron beam melting,EBM)技術(shù)制備的3D打印內(nèi)植物具有適宜的彈性模量,可以減低應(yīng)力遮擋及骨吸收。此外,金屬微孔結(jié)構(gòu)可以提供骨長入空間,從而提高內(nèi)植物的骨整合能力和長期穩(wěn)定性。然而金屬支架的生物惰性及RA的炎癥微環(huán)境不利于骨整合,因此我們需要在金屬微孔表面構(gòu)建新型的“生物活性界面”。作為生物活性物質(zhì)的載體,殼聚糖水凝膠可以提高金屬微孔界面的骨整合效率。水凝膠通過搭載外源性間充質(zhì)干細胞(MSCs),不僅可以提高金屬微孔界面的細胞粘附,而且利于發(fā)揮MSCs免疫調(diào)節(jié)作用、降低局部炎性水平,從而利于成骨分化潛能的發(fā)揮。在各類MSCs中,脂肪源性干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)具有較強的免疫調(diào)節(jié)能力。然而單獨應(yīng)用MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力較低,局部聯(lián)合應(yīng)用英夫利昔有望發(fā)揮協(xié)同抗炎作用。因此,本研究試圖構(gòu)建一種“3D打印金屬微孔/水凝膠/英夫利昔/ADSCs”的生物活性界面,其界面緩釋的英夫利昔與ADSCs發(fā)揮協(xié)同免疫調(diào)節(jié)作用,構(gòu)建利于成骨分化的微環(huán)境,促進金屬微孔-骨界面的整合能力。本研究可為RA等成骨不良的關(guān)節(jié)置換患者人工假體界面設(shè)計提供實驗支持。第一部分:脂肪源性干細胞(ADSCs)體外分離培養(yǎng)及其多向分化潛能和細胞表面標(biāo)志的檢測鑒定于家兔腹股溝皮下脂肪墊獲取脂肪組織,并用酶消化法分離培養(yǎng)ADSCs。研究結(jié)果表明:培養(yǎng)至第3代時,ADSCs細胞形態(tài)較一致,呈紡錘形或多角形;ADSCs的增殖速度較快。流式細胞術(shù)檢測表明CD44和Integrin-β呈強陽性,WT、CD34、CD31、c-kit和VCAM1呈弱陽性表達。成骨培養(yǎng)21天后,茜素紅染色可見紅色鈣化結(jié)節(jié)形成;成脂培養(yǎng)16天后,油紅O染色可見胞質(zhì)內(nèi)橙紅色脂滴。實驗結(jié)果表明所獲得的細胞為ADSCs,并且具有良好的增殖和多向分化潛能。第二部分:3D打印金屬微孔/水凝膠的生物活性界面的構(gòu)建采用EBM系統(tǒng)制備3D打印鈦合金微孔內(nèi)植物。研究結(jié)果表明:micro-CT顯示鈦合金微孔完全連通,其孔隙率為67±4%,孔徑為404±14μm,金屬小梁直徑為242±15μm。力學(xué)檢測結(jié)果顯示,其壓縮強度為104±3 MPa,彈性模量為4.9±0.2 GPa。利用氧化透明質(zhì)酸(HA-ALD),N-羧乙基殼聚糖(CEC)和己二酸二酰肼(ADH)的反應(yīng)制備殼聚糖水凝膠。室溫條件下,溶膠混合約20s可轉(zhuǎn)變?yōu)樗z;溶膠混合后可通過26號注射器,未見堵塞現(xiàn)象。孵育1小時,水凝膠表現(xiàn)平衡的溶脹狀態(tài),最大溶脹比達到50%。水凝膠可保持初始形態(tài),且未見明顯重量降低。體外和體外降解實驗:14天時水凝膠重量降低約為50%,30天時降解完全。用1mL注射器注射器將英夫利昔/ADSCs/A溶膠混合液從自上而下注入支架空隙,然后將B溶膠同樣注入支架空隙,靜置20 s進行液-固轉(zhuǎn)變,完成3D打印金屬微孔/水凝膠生物活性界面的構(gòu)建。SEM顯示粗糙的鈦合金微孔內(nèi)部可見具有均勻多孔結(jié)構(gòu)的水凝膠。第三部分:負載ADSCs水凝膠緩釋英夫利昔促進RA中3D打印金屬微孔界面的骨整合研究水凝膠體系可以實現(xiàn)英夫利昔的緩慢釋放,28天內(nèi)累計釋放率為71.06%。復(fù)合體系具有良好的細胞相容性;細胞在水凝膠體系中呈類球形。模擬RA炎癥微環(huán)境,評估各組細胞增殖水平。CCK-8實驗表明:培養(yǎng)4,7和14天后,微孔金屬界面/水凝膠/英夫利昔單抗組(MSHI組)的細胞增殖能力優(yōu)于其他各組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。模擬RA炎癥微環(huán)境,評估各組細胞成骨分化情況。ALP活性實驗表明:培養(yǎng)4和7天后,MSHI組ALP水平高于其他各組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;茜素紅染色和半定量結(jié)果表明:培養(yǎng)14和21天后,MSHI組礦化結(jié)節(jié)形成能力優(yōu)于其他各組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;PCR結(jié)果表明:MSHI組Runx2、ALP、Osterix和Col-I表達水平優(yōu)于其他各組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。將各復(fù)合體系植入RA模型動物股骨髁,術(shù)后12周評估關(guān)節(jié)炎癥水平和內(nèi)植物的骨整合能力。關(guān)節(jié)炎癥水平:MSHI組和(微孔金屬界面/水凝膠/英夫利昔單抗/ADSCs組)MSHIA組關(guān)節(jié)直徑明顯低于其他各組;MSHIA組TNF-α、IL-1、IL-6和卵清蛋白水平低于其他各組;MSHIA組和MSHI組滑膜炎癥水平低于其他各組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3D打印金屬微孔界面的骨整合能力:micro-CT結(jié)果表明MSHIA組微孔金屬界面的骨長入、骨密度和骨小梁結(jié)構(gòu)優(yōu)于其他各組;組織切片HE染色結(jié)果表明:MSHIA組微孔金屬界面周圍新骨較多、結(jié)合緊密,其內(nèi)部可見骨長入,明顯優(yōu)于其他各組;支架推出實驗表明:MSHIA組支架把持力優(yōu)于其他各組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R687.4;R318.08
【圖文】：

圖 1-1 具有分級結(jié)構(gòu)設(shè)計的 CAD 模型和打印內(nèi)植物1.5.3 3D 打印金屬微孔支架的骨科應(yīng)用3D 打印技術(shù)為定制復(fù)雜內(nèi)植物提供可能性。首先通過 CT 和 MRI 收集手術(shù)部位骨組織的數(shù)據(jù)，然后通過 CAD 軟件進行 3D 建模和拓撲優(yōu)化處理，并通過 3D 打印系統(tǒng)將金屬粉末制造為具有微孔結(jié)構(gòu)的金屬假體。定制的 3D 金屬內(nèi)植物具有多孔結(jié)構(gòu)，可以完美匹配手術(shù)部位骨組織解剖結(jié)構(gòu)（圖 1-2）。研究表明：RA 全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者使用具有微孔界面假體的術(shù)后翻修率顯著低于骨水泥型假體[72]。由此可見，具有微孔結(jié)構(gòu)界面的假體可以有效改善 RA 內(nèi)植物的長期穩(wěn)定性。中國食品藥品監(jiān)督管理局于 2015 年批準(zhǔn)具有微孔結(jié)構(gòu)界面的3D 打印金屬墊塊、髖臼杯和椎間融合器等內(nèi)植物的臨床應(yīng)用。然而，臨床上使

圖 1-2 3D 打印技術(shù)的內(nèi)植物制造的基本步驟示意圖：（a）CT 和 MRI 的數(shù)據(jù)收集病變數(shù)據(jù); （b）計算機設(shè)計模型并拓撲優(yōu)化; （c-e）內(nèi)植物的打印制備; （f）骨科應(yīng)用。1.6 金屬微孔界面的生物改性近年來，一系列的生物材料被研發(fā)并通過物理、化學(xué)和生物化學(xué)改性等方法來改善鈦合金的生物惰性，并取得了良好界面-骨整合效果[73]。其中，生物化學(xué)方法改性是將通過生物材料攜帶干細胞、多肽、生長因子等有機活性物質(zhì)引入植入物表面，可以直接有效地改善金屬表面生物活性。水凝膠是一種優(yōu)良的細胞載體，可以模擬細胞外基質(zhì)微環(huán)境，調(diào)控細胞遷移、增殖或分化[74，75]。

圖 1-3 實驗設(shè)計示意圖：通過載英夫利昔單水凝膠作為 ADSCs 載體填充孔隙結(jié)構(gòu)以構(gòu)建生物活性界面，明確界面結(jié)構(gòu)促進 RA 疾病狀態(tài)下金屬微孔-骨界面整合的能力。

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本文編號：2756881