【摘要】：研究背景和目的：骨缺損的治療是骨科醫(yī)生及科研工作者經(jīng)常面臨的難題。創(chuàng)傷、感染和骨腫瘤等致病因素導致的骨缺損難以自身愈合,其引起的功能喪失將影響患者的治療效果和生活質(zhì)量。在骨缺損的臨床治療中,經(jīng)常遇到結(jié)構(gòu)性骨缺損,以及骨折愈合不良、愈合困難甚至不愈合,嚴重時會導致骨不連等。臨床上用于修復骨缺損的替代材料包括自體骨移植、同種異體骨移植和人工骨材料。自體骨移植是目前臨床治療骨缺損的金標準,其是指移植的骨組織在同一個體的體內(nèi),由一處移向另一處。人體某些部位的骨組織被取出后,基本不會遺留明顯的功能障礙,而這些部位的骨組織往往是自體骨移植的理想供骨。自體骨移植所需的松質(zhì)骨常取自鎖骨或者髂骨,所需的皮質(zhì)骨常取自脛骨或者腓骨。自體骨具有極高的成骨能力和很小的免疫反應(yīng),但卻存在增加額外的創(chuàng)傷、來源極為有限、延長手術(shù)時間、增加失血量和手術(shù)感染的潛在可能性以及持續(xù)的慢性疼痛等缺點,從而限制了其臨床應(yīng)用。同種異體骨移植是指同種類的一個個體給另一個個體的骨組織移植。移植的骨組織具有不同的遺傳特征,同受體組織會發(fā)生較為嚴重的免疫排斥反應(yīng)及疾病傳播的潛在危險。其中,由同一結(jié)合子發(fā)育而來的兩個個體間的骨組織移植,稱為同基因骨組織移植。在這種情況下,兩個個體的遺傳特征較為接近,可無免疫排斥反應(yīng)或僅有輕微的排斥反應(yīng)。同種異體骨移植雖然來源比自體骨移植豐富,但其仍然存在免疫排斥反應(yīng)、愈合緩慢以及可能導致疾病的傳播與交叉感染等問題。人工骨材料是指一類可對機體骨組織進行修復、替代與再生,具有特殊功能作用的骨組織替代材料。該類人工材料在臨床的應(yīng)用,為患者較快的恢復正常的生理結(jié)構(gòu)和功能提供了可能,同時也避免了采用自體骨移植和同種異體骨移植所帶來的各種問題。人工骨材料按結(jié)構(gòu)或性質(zhì)可分為無機骨材料、有機骨材料和復合骨材料。人工骨材料可填充骨缺損部位,但不能誘導新生的骨組織生成,人工骨材料的材料學、生物學性能以及降解能力等問題均有待進一步解決。構(gòu)建復合骨替代材料即組織工程骨成為當今骨缺損治療研究的熱點,將促進骨愈合的藥物與基質(zhì)材料混合后聯(lián)合治療骨缺損是近來研究較多的一種方法。本項研究采用復乳溶劑蒸發(fā)法制備載阿侖膦酸鈉PLGA微球并將其與磷酸鈣骨水泥混合構(gòu)建構(gòu)的載阿倫磷酸鈉/磷酸鈣骨水泥復合組織工程骨,首先對其進行載藥量及其釋放規(guī)律、孔徑大小、孔隙率和力學性能等材料學特性的研究；其次通過體外實驗觀察其對兔骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及成骨誘導能力的效果評價其體外生物相容性和成骨性；最后通過構(gòu)建兔股骨髁骨缺損模型,將載阿倫磷酸鈉/PLGA/磷酸鈣復合組織工程骨植入骨缺損部位,通過影像學和組織學指標評價其體內(nèi)生物相容性和成骨性。本項實驗旨在研究制備搭載阿倫磷酸鈉的PLGA微球與磷酸鈣骨水泥復合后的組織工程骨,評估其體外和體內(nèi)生物相容性和成骨活性,探討其修復兔股骨髁骨缺損的效果及加速修復骨缺損的作用。本項研究有望能為臨床促進骨缺損區(qū)修復提供一種新的治療方法。本項研究分為以下三部分：(1)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC組織工程骨的材料學性質(zhì)研究；(2)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC組織工程骨的體外生物相容性和成骨分化活性的研究；(3)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC組織工程骨的體內(nèi)生物相容性和促進骨缺損愈合的研究。現(xiàn)將本研究的主要內(nèi)容簡要介紹如下。(一)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨的材料學性質(zhì)研究方法：運用復乳溶劑蒸發(fā)法(W/O/W)制備載阿倫磷酸鈉PLGA微球。采用JSM-6390掃描電鏡觀察微球的微觀形態(tài),測量其粒徑大小和分布情況；采用酶標儀測定載阿倫磷酸鈉PLGA微球的載藥和緩釋性能。微球與磷酸鈣骨水泥混合制備阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨。采用阿基米德法測定組織工程骨的孔隙率；采用JSM-6390掃描電鏡測量組織工程骨的孔徑大�。徊捎肦GD-5型萬用測試儀測定組織工程骨的力學性能(抗壓強度)。結(jié)果：復乳溶劑蒸發(fā)法(W/O/W)成功制備出外表圓潤、粒徑200-300μm、粒徑分布均勻的載阿倫磷酸鈉PLGA微球。載阿倫磷酸鈉PLGA微球與單純PLGA微球的外觀、粒徑大小和分布沒有明顯差異。PLGA微球?qū)τ诎惲姿徕c的載藥率為75.12%,可緩慢釋放阿倫磷酸鈉達28天。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合材料孔隙率67.43土4.2%,孔徑213±95μm,抗壓強度達到5.79±1.21Mp,與松質(zhì)骨相當,可基本滿足臨床要求。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合材料與PLGA/CPC材料的孔隙率、孔徑和抗壓強度沒有明顯差異。結(jié)論：1.PLGA是良好的阿倫磷酸鈉的載體和緩釋體,載阿倫磷酸鈉的PLGA微球在降解后可使阿倫磷酸鈉緩慢釋放。2.載阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨具有良好的材料學性能,有合適的孔徑結(jié)構(gòu)和力學性能。(二)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨的體外生物相容性和成骨分化活性的研究方法：Percoll密度梯度分離法獲取兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),體外培養(yǎng)純化,倒置顯微鏡觀察其生長狀態(tài)。分別將阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨和單純PLGA/CPC組織工程骨與生長狀況良好的第三代兔骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng),通過掃描電鏡觀察細胞生長形態(tài)；采用CCK-8活細胞計數(shù)實驗測定細胞的黏附和增殖；采用流式細胞周期測定材料對于細胞周期的影響；堿性磷酸酶活性和堿性磷酸酶染色評估其對細胞的成骨分化活性。結(jié)果：載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合材料在體外對骨髓間充質(zhì)干細胞有著良好的體外生物相容性和成骨分化活性。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨與細胞粘附性良好,粘附細胞的形態(tài)正常。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨組的黏附、增殖性顯著增高(P0.05)。細胞接種后,載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨組的細胞的分裂增殖速度顯著高于單純PLGA/CPC組織工程骨和空白對照組(P0.05)。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨組的堿性磷酸酶活性顯著增高(P0.05),堿性磷酸酶染色的陽性細胞也顯著高于單純PLGA/CPC組織工程骨和空白對照組。結(jié)論：體外實驗顯示載阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨具有良好的生物相容性和成骨活性,可促進兔骨髓間充質(zhì)干細胞的黏附、增殖和成骨分化。(三)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨的體內(nèi)生物相容性和促進骨缺損愈合的研究方法：山東大學動物實驗中心提供的45只健康新西蘭成年大白兔(23雌,22雄；體重2.0-3.0kg),手術(shù)建立股骨髁骨缺損的模型,隨機分為A、B、C 3組,每組15只。A組為假手術(shù)組(單純股骨髁骨缺損組),B組骨缺損后植入PLGA/CPC組織工程骨,C組骨缺損后植入阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨。每只動物均一側(cè)行手術(shù)操作。術(shù)后6周和12周分批處死動物后取材評估,行大體解剖觀察、X線攝片、Micro-CT掃描分析(骨覆蓋率和骨密度值)和組織學觀察。結(jié)果：兔股骨髁骨缺損動物實驗顯示載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨同樣有著良好的體內(nèi)生物相容性和成骨分化活性。植入后6周和12周,復合材料組的骨缺損修復均優(yōu)于對照組。假手術(shù)組(單純股骨髁骨缺損組)股骨髁骨缺損未見明顯愈合；X線攝片示骨缺損處透光明顯；Micro-CT顯示骨覆蓋率(bone coverage)在6周和12周分別為3.40±2.25%和6.10±4.48%,骨密度值(BMD)在6周和12周分別為31.04±5.8mg/cm3 和 50.80±8.8mg/cm3; HE染色顯示骨缺損處可見大量的纖維細胞,少見新骨形成。PLGA/CPC組織工程骨組股骨髁骨缺損見部分愈合；X線攝片示骨缺損處透光較弱；Micro-CT顯示骨覆蓋率在6周和12周分別為12.89±5.74%和20.24±9.25%,骨密度值在6周和12周分別為57.08±8.4mg/cm3 和 81.80±10.8mg/cm3; HE染色示骨缺損處可見少量的纖維細胞,可見部分新骨形成,但新生骨小梁較為薄弱。阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨組股骨髁骨缺損見基本愈合；X線攝片示骨缺損處透光最弱；Micro-CT顯示骨覆蓋率在6周和12周分別為25.78±6.89%和45.0±11.62%,骨密度值在6周和12周分別為88.92±9.9mg/cm3 和115.98±12.2mg/cm3； HE染色示骨缺損處可見極少量的纖維細胞,可見大量的新骨形成,新生骨小梁粗大。結(jié)論：動物實驗證實載阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨治療骨缺損效果可靠,能夠促進兔股骨髁骨缺損局部的新骨形成,加速骨缺損的修復和愈合。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2754649