【摘要】：角膜是位于眼球最前端的一層透明薄膜，呈橫橢圓形，覆蓋虹膜、瞳孔及前房，并為眼睛提供大部分屈光力。角膜從解剖結(jié)構(gòu)上可分為5層：上皮層、前彈力層（Bowman層）、基質(zhì)層、后彈力層（Descemet膜）、內(nèi)皮層。其中基質(zhì)層約占角膜總厚度的90%，含有大量規(guī)則排列的膠原纖維板，分枝狀的角膜基質(zhì)細(xì)胞則鋪展于膠原纖維之間，對維持角膜的透明性發(fā)揮著重要作用。角膜疾病是僅次于白內(nèi)障的第二大致盲主因，其中，由角膜基質(zhì)缺損所導(dǎo)致的角膜盲占多數(shù)。目前，角膜移植是治療角膜盲的唯一有效手段，但由于供體角膜嚴(yán)重不足，我國眼庫每年僅能提供約一千余人手術(shù)所用眼角膜。因此，尋求良好的角膜等效替代品是解決供體角膜數(shù)量不足的重要途徑。隨著組織工程研究的不斷推進(jìn)，通過體外重建獲得具有生物活性的組織工程角膜成為可能。組織工程人角膜基質(zhì)有望成為供體角膜基質(zhì)的等效替代物，從根本上解決捐獻(xiàn)角膜高度匱乏的問題。 支架材料在組織工程角膜研究中起關(guān)鍵作用，它不僅為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，而且還起到模板的作用，引導(dǎo)組織再生和控制組織結(jié)構(gòu)。因此，選擇一種具有良好生物相容性和特定形狀結(jié)構(gòu)的支架材料是組織工程角膜成敗的關(guān)鍵因素。本文以豬角膜為研究材料，選擇合適的脫細(xì)胞方法，制備出理想的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)（acellular porcine corneal stroma，aPCS）載體支架，并利用本實(shí)驗(yàn)室自行建立的非轉(zhuǎn)染、無致瘤性人角膜基質(zhì)細(xì)胞系對制備的aPCS支架進(jìn)行了鑒定和生物相容性研究，為組織工程人角膜基質(zhì)及組織工程全角膜的體外重建奠定了基礎(chǔ)。 本文利用0.5%脫氧膽酸鈉聯(lián)合DNase/RNase對豬角膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，徹底去除支架內(nèi)殘留的核物質(zhì)，經(jīng)風(fēng)干處理后制備出脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)支架。利用石蠟切片HE染色和冰凍切片DAPI熒光染色等方法鑒定脫細(xì)胞效果，利用阿利新蘭染色法鑒定細(xì)胞外基質(zhì)成分的保存情況，利用石蠟切片HE染色和透射電鏡觀察等方法鑒定膠原板層結(jié)構(gòu)的維持。結(jié)果顯示，制備出的aPCS支架無角膜基質(zhì)細(xì)胞膜碎片和核酸碎片殘留，糖胺聚糖分布與對照相似，膠原纖維排列整齊規(guī)則，表明aPCS支架保持了完整的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和糖蛋白成分。此外，脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)光學(xué)透明度良好。為了檢測支架與細(xì)胞的生物相容性，利用注射法將非轉(zhuǎn)染、無致瘤性人角膜基質(zhì)細(xì)胞系接種在制備好的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)支架，通過冰凍切片HE染色及免疫化學(xué)染色方法對其進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，細(xì)胞接種1天、3天、5天及7天，脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)支架內(nèi)部的膠原纖維板層間均有人角膜基質(zhì)細(xì)胞的定位，且隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞呈現(xiàn)向外擴(kuò)散的趨勢。人角膜基質(zhì)細(xì)胞在支架內(nèi)能夠陽性表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白-波形蛋白，細(xì)胞連接蛋白-整聯(lián)蛋白β1、間隙連接蛋白-43，基質(zhì)細(xì)胞功能蛋白-乙醛脫氫酶3A1、鈉鉀泵、鈣泵，細(xì)胞生長增殖相關(guān)蛋白-K-Ras、STAT3、CDK2，分化相關(guān)蛋白-CD34，這與體外培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)情況相同。以上結(jié)果表明細(xì)胞在支架內(nèi)生長狀態(tài)良好，能夠發(fā)揮正常功能，證實(shí)支架的生物相容性良好，能夠?yàn)榧?xì)胞的生長、分化及正常功能的發(fā)揮提供適宜的環(huán)境。 綜上所述，本文利用新鮮豬角膜成功制備了脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)支架，該支架無角膜基質(zhì)細(xì)胞殘留，糖胺聚糖分布正常，膠原纖維排列整齊規(guī)則，透明度高。將人角膜基質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞接種到aPCS支架后，細(xì)胞生長狀態(tài)良好、增殖分裂旺盛，基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白、連接蛋白、功能蛋白、生長增殖相關(guān)蛋白及分化相關(guān)蛋白均表達(dá)為陽性，表明制備的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)支架具有良好的生物相容性，為組織工程角膜基質(zhì)及組織工程全層角膜的體外重建奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08
【圖文】：

圖 2-1 脫細(xì)胞處理過程中角膜片跟蹤觀察照片F(xiàn)ig. 2-1 Transparency of porcine cornea during acellular processA: 正常豬角膜; B: 溶脹 12h 并去除上皮; C: 脫細(xì)胞緩沖液處理 8h; D: 反復(fù)凍 融;E：DNA- RNA 酶處理 4h; F: 風(fēng)干后; G: 復(fù)水 12hA: Normal porcine cornea; B: Hydrating for 12h and removing epithelium; C: Treatment withdecellularization buffer for 24 h; D: Repetitive freeze-thawing; E: Treatment with DNase/RNasefor 4 h; F: Air-dried; G: Rehydrating for 12h.3.1.2 透光率如圖 2-2 所示，風(fēng)干 12h 的 aPCS 支架透光率達(dá)到了 96.43%±1.6%，復(fù)水后aPCS 支架透光性有所下降，為 78.50%±5.4%。

圖 2-1 脫細(xì)胞處理過程中角膜片跟蹤觀察照片F(xiàn)ig. 2-1 Transparency of porcine cornea during acellular proces膜; B: 溶脹 12h 并去除上皮; C: 脫細(xì)胞緩沖液處理 8h; D:E：DNA- RNA 酶處理 4h; F: 風(fēng)干后; G: 復(fù)水 12hporcine cornea; B: Hydrating for 12h and removing epithelium; C: Ttion buffer for 24 h; D: Repetitive freeze-thawing; E: Treatment withfor 4 h; F: Air-dried; G: Rehydrating for 12h.-2 所示，風(fēng)干 12h 的 aPCS 支架透光率達(dá)到了 96.43%±1光性有所下降，為 78.50%±5.4%。

3.2.1 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)HE染色結(jié)果如圖 2-3A 所示，新鮮豬角膜與人類角膜較相似。溶脹、撕除上皮后，上皮細(xì)胞基本被去除，角膜基質(zhì)層中有較多細(xì)胞殘留（圖 2-3B）。脫細(xì)胞緩沖液處理8h 后，上皮細(xì)胞被徹底去除，基質(zhì)中仍殘留少量細(xì)胞，角膜膠原板層結(jié)構(gòu)變得較為松散（圖 2-3C）。經(jīng)過反復(fù)凍融后，基質(zhì)層中殘留的細(xì)胞基本被去除，膠原板層結(jié)構(gòu)較之前無明顯變化（圖 2-3D）。之后經(jīng) DNA-RNA 酶處理后，殘留的微量核物質(zhì)被徹底去除（圖 2-3E）。風(fēng)干處理后，膠原纖維結(jié)構(gòu)恢復(fù)整齊排列，無局部結(jié)構(gòu)破壞（圖 2-3F）。3.2 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)

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本文編號：2744580