【摘要】：目的:在心血管外科領域,膨體聚四氟乙烯(expanded polytetrafluoroethylene,ePTFE)或聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)在臨床上常用于重建大動脈。然而,這些合成材料制作的人工血管,用于小口徑動脈(內(nèi)徑≤6mm,如冠狀動脈或下肢動脈旁路移植)重建時臨床結(jié)局很不理想,組織相容性差,在血管腔形成血栓、內(nèi)膜過度增生或感染易導致人工血管管腔閉塞。對于這樣的小動脈旁路移植術,自體動脈(如胸廓內(nèi)動脈和橈動脈)或靜脈(如大隱靜脈)仍然是最理想的血管替代物。但是,通常由于自體血管質(zhì)量低劣或數(shù)量不足,來源有限,不能夠總是輕易獲取。小口徑動脈的人工血管替代物是多年研究的熱點和難點。采用自體血管壁細胞作為種子細胞進行人工血管培育或種植的方法,取得過一些成果,但缺點也很明顯,自體細胞的獲取是創(chuàng)傷性的,自體細胞預處理、種植或生物反應器培養(yǎng)的程序比較繁瑣,周期長,人工血管也非常容易感染。如今,日益增長的心血管問題更多的需要現(xiàn)成的小口徑人工血管,而不需要從患者身上獲取組織或細胞,因此,研發(fā)新型適應臨床需求的小口徑人工血管很有必要。在本研究中,我們基于可生物降解的豬小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)與可得然(curdlan)膠和雙嘧達莫(dipyridamole,DIP)混合膜作為夾心的“三明治”,成功設計制作了復合的“三明治”夾心小口徑人工血管。本研究的目的是檢測該人工血管體外的生物學性能、研究移植到兔頸總動脈的通暢和重構(gòu)情況,以及調(diào)控影響復合小口徑人工血管內(nèi)皮化及內(nèi)膜增生的機制及臨床應用前景初探。研究方法:按照Abraham的方法制備SIS并脫細胞和消毒處理,使用交聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDC)對SIS進行肝素涂層。對肝素與SIS結(jié)合的體外釋放率進行了測試。Curdlan膠作為DIP載體。不同濃度的curdlan膠和DIP混合膜作為夾心,制作雙層SIS的“三明治”,體外測試了DIP的釋放率,血小板(platelet,PLT)黏附實驗,溶血實驗,人工材料對血管內(nèi)皮細胞(endothelial cells,ECs)及血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的增殖率影響及毒性實驗。制作了三種類型的人工血管(2mm內(nèi)徑,長度20 mm):10%curdlan膠和10%DIP混合膜作為夾心的“三明治”雙層SIS人工血管(SIS curdlan DIP,SCD),10%curdlan膠膜作為夾心的“三明治”雙層SIS人工血管(SIS curdlan,SC),單層SIS人工血管(SIS,S),體外測試人工血管的力學性能,人工血管被分別旁路移植到兔子頸總動脈(native carotid artery,NCA)并飼養(yǎng)2~3個月,未手術兔的NCA作為對照組,每組16只兔子。多普勒超聲及CT隨訪觀察人工血管的通暢情況,取材后從大體外觀、內(nèi)膜電鏡掃描、膠原及彈力纖維定性及定量分析、形態(tài)學、免疫熒光及蛋白免疫印跡來評價人工血管的體內(nèi)重構(gòu)特性。并通過細胞周期及信號通路檢測的方法對調(diào)控影響復合小口徑人工血管內(nèi)皮化及內(nèi)膜增生的機制進行了研究。結(jié)果:SIS經(jīng)HE染色,脫細胞前黏膜層側(cè)比較光滑,肌層側(cè)比較粗糙,可見細胞核。脫細胞后的SIS黏膜層側(cè)變化不大,并且細胞核消失,說明脫細胞比較充分。掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察顯示脫細胞后肌層側(cè)變得更為疏松,形成孔徑介于20~200微米的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。肝素與SIS結(jié)合后,第一個24小時釋放(18.5±3.5)%,此后體外20天的釋放曲線比較平緩,逐漸釋放共達(94.3±2.4)%,說明肝素通過交聯(lián)結(jié)合比較牢靠。通過檢測熒光強度定量測定結(jié)果表明,經(jīng)過91天的體外釋放測試,SIS+10%curdlan+10%DIP“三明治”材料中DIP共釋放了(21.8±6.2)%,明顯低于SIS+2.5%curdlan+10%DIP的(67.5±7.2)%和SIS+5%curdlan+10%DIP的(49.4±9.5)%。取材的SCD人工血管的DIP釋放量:2-mo大約釋放(53.39±3.52)%,3-mo釋放達到(91.01±4.79)%。PLT黏附實驗顯示,未交聯(lián)肝素的SIS的PLT黏附率比較高,PLT保留指數(shù)%PRI=(59.2±6.7)%,交聯(lián)肝素后%PRI=(11.2±2.4)%,“三明治”SIS+10%curdlan%PRI=(9.5±2.7)%,“三明治”SIS+10%curdlan+10%DIP的%PRI=(3.3±0.6)%。溶血實驗顯示所有材料的溶血率都低于5%。MTT實驗顯示隨著DIP濃度加大,對于VSMCs增殖的抑制越強,小于等于10%DIP夾心的材料對于ECs增殖有促進作用。機械性能測試顯示SCD,SC的爆破壓優(yōu)于S組。人工血管植入后,閉塞的和其余的隨機共占各組一半的實驗兔(每組8例)在2個月處死,其余的飼養(yǎng)到3個月。隨訪多普勒顯示8例SCD在2個月都通暢,6/16(37.5%)的SC人工血管和5/16(31.25%)的S人工血管在2個月閉塞。這些取材的移植物組織學分析免疫熒光技術顯示,所有通暢人工血管存在顯著宿主細胞浸潤和不同程度的ECs覆蓋。SC和S人工血管的閉塞是由于血栓形成。在3個月,1例SCD閉塞,通暢的SCD表現(xiàn)為融合和有功能的內(nèi)皮,無內(nèi)膜過度增生,并且新生內(nèi)膜層包含沿圓周排列的VSMCs,SC和S人工血管顯示不完全內(nèi)皮化和不同程度的內(nèi)膜附壁血栓,SC人工血管閉塞(3/8)、S人工血管閉塞(2/8)。3個月SCD人工血管取材的膠原蛋白定性及定量分析顯示膠原所占比例接近于兔頸總動脈,而各組彈性蛋白所占比例均小于兔頸總動脈,并且沒有纖維彈性蛋白形成的證據(jù),說明組織重構(gòu)尚不完全。蛋白免疫印跡研究結(jié)果表明,SCD的eNOS表達高于SC及S,α-SMA及MYH表達低于SC及S,說明DIP具備促進內(nèi)皮化及抑制VSMCs過度增生的作用。細胞周期檢測顯示DIP能夠增加ECs的G2和S期比例,同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)使ECs增殖停滯于G1期,DIP能夠部分逆轉(zhuǎn)Hcy對于ECs細胞周期的影響。與之相反的是,Hcy能夠增加VSMCs的G2和S期比例,DIP使VSMCs增殖停滯于G1期,DIP能夠部分逆轉(zhuǎn)Hcy對于VSMCs細胞周期的影響。Hcy及DIP和不同阻斷劑干預會導致影響HUVECs功能cAMP依賴的信號通路產(chǎn)生變化,Hcy及DIP和不同阻斷劑干預會導致影響HASMCs增殖cAMP依賴的信號通路產(chǎn)生變化。結(jié)論:體外研究表明,新鮮取材的SIS經(jīng)過一系列的脫細胞和消毒處理程序,在EDC輔助下實現(xiàn)了肝素交聯(lián)和緩釋,以10%curdlan+10%DIP混合膜作為雙層SIS“三明治”夾心的復合小口徑人工血管,具備良好生物機械性能、血液相容性和ECs相容性,同時能夠抑制VSMCs的增殖,DIP以curdlan作為載體,能夠達到長期緩釋的目的。動物實驗結(jié)果表明,交聯(lián)肝素,以及curdlan凝膠負載DIP的藥物緩釋系統(tǒng)作為人工血管“三明治”夾心,提高了抗PLT黏附性能,有效的預防了血栓形成。DIP抑制了人工血管內(nèi)膜的過度增生并促進了早期內(nèi)皮化。信號通路研究顯示,DIP可以通過cAMP依賴的PKA-RhoA、Epac-PI3K通路共同逆轉(zhuǎn)Hcy誘導的HUVECs功能障礙。DIP可以通過cAMP依賴的PKA、Epac-MEK通路共同抑制Hcy誘導的HASMCs增生。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R654;R318.1
【圖文】：

圖 1.1 SIS 的獲取及脫細胞過程。素交聯(lián)到 SIS 及肝素釋放率實現(xiàn)肝素化，SIS 片浸入 pH為1.5 的50ml 2（-N-嗎啉）乙磺酸緩沖物技術有限公司，中國），包含 20mM 的 N-羥基琥珀酰亞胺（N試劑，中國），20mM 的 EDC（麥克林，中國），和肝素鈉（千紅00 U，100mg），然后在 37℃輕輕攪拌 36h。肝素通過 SIS 表面 NH為了中和反應并除去未結(jié)合的肝素，SIS 在 PBS 中輕柔漂洗。通解的肝素濃度與初始濃度比較，確定固定在 SIS 上的肝素量。苯胺藍法測定 SIS 釋放肝素的量。肝素化的 SIS 浸泡于 50ml PBSl 上清液，再往 50ml PBS 的試管中添加 2.5ml 新的 PBS，上清液與0.005 wt％)混合，室溫 1 分鐘。用 5ml 己烷（滬試，中國）萃取甲合物。反應在離心前 30 分鐘進行。然后由多功能酶標儀 (Thermo 下面的水溶液在 631 nm 處的吸光度（一個空的背景吸光度從每個值

圖 1.2 肝素交聯(lián)到 SIS 所用試劑，原理，肝素釋放率測定酶標儀。2.2.3 Curdlan 和 DIP 混合膜，復合支架的構(gòu)建在常溫下，curdlan（貨號 C7821-5G，Sigma-Aldrich）和 DIP（貨號 D9766-5G，Sigma-Aldrich，美國）不溶于水。因此，均質(zhì)機(DragonLab OS40-Pro，中國)1500轉(zhuǎn) 30 分鐘被用來生產(chǎn)分散的 curdlan 和 DIP 懸浮液。細胞附著的鑒定及 ECs 和VSMCs 的 MTT 法檢測時，curdlan 的濃度為 10%，curdlan 和 DIP 的混懸液中，DIP的濃度依次為 0、2.5、5、10%（w/v）。檢測在不同濃度的 curdlan 膠中 DIP 的釋放率，curdlan 濃度分別為 2.5、5, 10%（w/v），DIP 的濃度為 10%。在玻璃皿中，計算復合懸浮液的體積和玻璃皿底面積，均勻分散混懸液，加熱超過 80℃ 20 分鐘，制得 200μm 厚的 curdlan 和 DIP 混合膜。該膜被切割成合適的大小（9×9mm），作為 1cm2雙層 SIS“三明治”的夾心。SIS的黏膜側(cè)面向外側(cè)。復合支架的開口邊緣用 8-0 Prolene 線連續(xù)縫合關閉(Johnson &Johnson, 美國)。見圖 1.3。單層 SIS 或 10%curdlan 負載濃度梯度 DIP 的復合材料，

【參考文獻】

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1 孫秀娟;范代娣;朱晨輝;馬曉軒;駱艷娥;陳嵐;郭佳慶;;類人膠原蛋白-透明質(zhì)酸血管支架的性能及生物相容性[J];生物工程學報;2009年04期

本文編號：2724761