【摘要】：一、研究背景和目的背景:組織工程皮膚(tissue engineered skin,TES)移植在創(chuàng)面修復中具有較大的應(yīng)用前景,當前的TES因涉及保存、運輸、長時間的制備過程等多種技術(shù)問題,還不能滿足臨床的各種應(yīng)用需求。三維生物打印為皮膚組織工程提供更強大的技術(shù)支持,它應(yīng)用生物“墨水”定位負載活細胞、核酸和生長因子等,逐層打印,精確構(gòu)建所需的組織或器官,并可保持較高的細胞活性。然而尋找適合的生物墨水是三維生物打印面臨的主要挑戰(zhàn),膠原及明膠由于其良好的生物相容性,是最常用的天然水凝膠,然而這些水凝膠機械性能不足,降解速度較快,用作皮膚支架存在局限性。脫細胞真皮基質(zhì)(ADM)通過對皮膚組織脫細胞化處理獲得,具有與天然細胞外基質(zhì)(ECM)相似的組分和微環(huán)境,適合細胞的黏附,生長和增殖。甲基丙烯酸酐化明膠(GelMA)通過對明膠化學修飾后獲得,具有廣泛可調(diào)的機械性能,經(jīng)藍光光照幾分鐘甚至幾秒鐘后,能夠形成高度交聯(lián)的聚合物。目的:利用三維生物打印技術(shù)構(gòu)建組織工程皮膚——負載成纖維細胞的ADM-GelMA復合水凝膠。制備脫細胞真皮基質(zhì)并測定其成分,將ADM-GelMA復合水凝膠和單獨的ADM水凝膠以及GelMA水凝膠對比,進行三維成型評估,測定流變學特性、微觀結(jié)構(gòu)以及細胞增殖活性。二、方法采用低溫冷凍、酶消化和化學試劑相結(jié)合的方式(0.25%Trypsin/1%Triton X-100)對豬皮進行脫細胞處理,獲得ADM,對其成分進行測定。GelMA由浙江大學高分子系實驗室提供,取代度為70%。以單獨的ADM水凝膠和GelMA水凝膠作為對照組,以ADM-GelMA復合水凝膠作為實驗組,將成纖維細胞懸液與水凝膠均勻混合,應(yīng)用擠出型三維打印機進行三維成型評估。利用CCK-8測定各組水凝膠中細胞的增殖活性,使用活細胞死細胞試驗評價打印后的組織構(gòu)建體中成纖維細胞(Fbs)的活性,用掃描電子顯微鏡觀察支架的微觀結(jié)構(gòu)。采用Student-t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。三、結(jié)果(1)蘇木素/伊紅(HE)染色結(jié)果顯示,ADM中幾乎沒有鏡下可見的細胞殘留,經(jīng)過脫細胞步驟后,由于去除一定量的細胞成分,膠原的含量有所提高,糖胺聚糖(GAG)的含量是脫細胞前GAG含量的54.5%。(2)三維打印結(jié)果顯示:GelMA水凝膠和ADM-GelMA復合水凝膠在打印過程成均能實現(xiàn)快速交聯(lián),具有良好的結(jié)構(gòu)保真度,ADM水凝膠由于交聯(lián)時間較長(半小時),打印過程中逐漸出現(xiàn)結(jié)構(gòu)塌陷。(3)掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,三種水凝膠均具有相互交通的孔隙結(jié)構(gòu)。(4)CCK-8測定結(jié)果顯示,ADM水凝膠和GelMA水凝膠中成纖維細胞(FBs)的增殖活性均隨著水凝膠濃度的增加而降低,ADM水凝膠和ADM-GelMA復合水凝膠中FBs的細胞增殖活性大于5%GelMA。(5)活細胞死細胞染色以及鬼筆環(huán)肽/Hoechst33258染色結(jié)果顯示,第7天時FBs在水凝膠中均生長良好,說明打印過程對細胞的損害幾乎可以忽略。四、結(jié)論本實驗設(shè)計了負載成纖維細胞的ADM-GelMA復合水凝膠,用于三維打印構(gòu)建皮膚真皮替代物。研究結(jié)果表明,負載成纖維細胞的ADM-GelMA復合水凝膠同時具備良好的生物相容性以及較強的機械性能,并且凝膠化時間短,打印構(gòu)建體保真度高,是用于三維生物打印較具前景的生物墨水,將來有望作為皮膚真皮替代物應(yīng)用到皮膚創(chuàng)面修復中。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R318.08
【圖文】：

３三維打�。粒模退z逡逑應(yīng)用擠出型三維生物打印機，我們成功打印了直徑３０ｍｍ，高ｌｍｍ的生物構(gòu)逡逑建體（圖１．３Ａ）。１．５％ＡＤＭ水凝膠由于交聯(lián)時間長，粘滯度不足，在打印過程中逡逑逐漸出現(xiàn)塌陷塌陷，細絲直徑在１ｍｍ。逡逑１１逡逑

４體外測定細胞活性逡逑為評價不同濃度的ＡＤＭ水凝膠中ＦＢｓ的增殖活性，我們對其進行ＣＣＫ－８測定。逡逑結(jié)果顯示，隨著ＡＤＭ水凝膠濃度的增加，ＦＢｓ的增殖活性逐漸降低（圖１．４），１％ＡＤＭ逡逑和１．５％ＡＤＭ水凝膠中ＦＢｓ的細胞增殖活性明顯高于２％ＡＤＭ水凝膠，考慮到逡逑１．５％ＡＤＭ具有較好的生物相容性；且與１％ＡＤＭ水凝膠相比更適合應(yīng)用到擠出型逡逑三維打印機，因此我們選定１．５％ＡＤＭ作為對照組。逡逑１．２０逡逑，００邋１邋—逡逑０．８０逡逑Ｈ邋０．６０逡逑：ｉ．．邋ｉｌｌ邐ＩＩＩ逡逑Ｄ１邐Ｄ３邐Ｄ７逡逑■邋１．０％ＡＤＭ邋■邋１．５％ＡＤＭ邋■邋２％ＡＤＭ逡逑圖１．４邋１％ＡＤＭ水凝膠、１．５％ＡＤＭ水凝膠以及２％ＡＤＭ水凝膠的ＣＣＫ－８測定值（＊／７＜０．０５）逡逑１２逡逑

【相似文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 陳浩嬌;ADM-GeIMA復合水凝膠三維打印皮膚真皮替代物的可行性研究[D];浙江大學;2019年

本文編號：2718438