發(fā)布時(shí)間：2020-06-01 20:38

【摘要】：目的:將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,成骨細(xì)胞以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)體外構(gòu)建三維微組織,并植入裸鼠皮下觀察其異位成骨的能力。方法:1.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的分離與培養(yǎng):全骨髓貼壁法獲得rBMSCs并培養(yǎng)純化,貼壁細(xì)胞達(dá)到90%左右時(shí)傳代,進(jìn)行形態(tài)觀察及生長記錄。2.兔成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化:取融合至80%-90%的P2代rBMSCs,更換為成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)成骨,連續(xù)誘導(dǎo)14天后收獲以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)并檢測成骨特性。3.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng):將液氮中凍存的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞取出,水浴復(fù)蘇原代細(xì)胞,顯微鏡下觀察形態(tài)及生長狀況,傳代培養(yǎng)后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.三維微組織的體外構(gòu)建:將三維微組織分為兩組,一組為成骨細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞1:1混合(OB組),以5×10~4個(gè)/cm~2的密度接種至96孔低黏附培養(yǎng)板中,隔天換液培養(yǎng)7天;一組為成骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞1:1:1混合(共培養(yǎng)組),同樣以5×10~4個(gè)/cm~2的密度接種至96孔低黏附培養(yǎng)板中,隔天換液培養(yǎng)7天。5.兩組三維微組織植入裸鼠皮下:將每96個(gè)微球注射植入一只裸鼠皮下位點(diǎn),于植入后2周、4周通過大體觀察、HE染色、茜素紅染色、堿性磷酸酶染色及CD31免疫熒光染色等檢測植入微球的成骨能力和成血管能力。結(jié)果:1.成功分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞呈長梭形,旋渦狀生長。2.成功誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞,成骨細(xì)胞呈多角形或立方形,表面有短突起,茜素紅染色見橙紅色鈣結(jié)節(jié)。3.復(fù)蘇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇后為P1代,貼壁生長,呈“鋪路石狀“排列。細(xì)胞扁平多角形。4.成功構(gòu)建三維微組織:細(xì)胞在96孔低黏附培養(yǎng)板中培養(yǎng)1周,肉眼觀察可見細(xì)胞聚集成球狀,兩組茜素紅染色及堿性磷酸酶染色表明兩組微球均有成骨能力,CD31免疫熒光顯示共培養(yǎng)組有成血管潛力。5.植入2周,OB組與共培養(yǎng)組植入位點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)組織結(jié)節(jié),4周后,兩組植入位點(diǎn)處組織結(jié)節(jié)變小,邊界清晰,表面按壓較硬。HE及茜素紅染色發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組較OB組成骨多,CD31染色發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組形成血管數(shù)目遠(yuǎn)多于OB組。結(jié)論:1.使用低黏附培養(yǎng)板可以比較簡單易操作地形成三維微組織,且其質(zhì)地較為緊密。2.用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外構(gòu)建的三維微組織植入裸鼠體內(nèi)后具有成骨成血管的能力。
【圖文】：

約覆蓋培養(yǎng)瓶底部 40%。72 小時(shí)后，細(xì)胞分裂增殖狀況良好（圖1A），貼壁細(xì)胞呈短梭形、多角形，繼續(xù)再培養(yǎng) 2 天，細(xì)胞呈集落形生長，形狀變?yōu)殚L梭形，培養(yǎng)至 1 周時(shí)，多個(gè)細(xì)胞集落相互融合，細(xì)胞融合約 90%時(shí)，傳代培養(yǎng)，24 小時(shí)后細(xì)胞貼壁，呈長梭形，48 小時(shí)后迅速增殖，繼續(xù)培養(yǎng) 3-4 天，細(xì)胞再次融合覆蓋瓶底，呈漩渦或平行狀（圖 1B）圖 1 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 2 天和 10 天圖注：A 為培養(yǎng) 2 天時(shí)由塊狀骨髓爬行生長的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；B 為培養(yǎng) 10天時(shí)的兔間充質(zhì)干細(xì)胞（scale bar=100μm）3.2 兔成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化形態(tài)觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代至 P2 代后

圖 1 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 2 天和 10 天圖注：A 為培養(yǎng) 2 天時(shí)由塊狀骨髓爬行生長的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；B 為培養(yǎng) 10天時(shí)的兔間充質(zhì)干細(xì)胞（scale bar=100μm）3.2 兔成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化形態(tài)觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代至 P2 代后，，細(xì)胞形態(tài)均勻，呈長梭形（圖 2A），誘導(dǎo) 7 天后，細(xì)胞變大變短，表面有細(xì)小突起，胞核變大而圓（圖 2B），誘導(dǎo) 14 天后，細(xì)胞變?yōu)槎嘟切位蛄⒎叫�，表面短突起與相鄰細(xì)胞連接，胞核位于細(xì)胞一端（圖 2C）
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R68;R318.08

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本文編號：2692032