【摘要】：目的:將兔骨髓間充質(zhì)干細胞,成骨細胞以及人臍靜脈內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)體外構建三維微組織,并植入裸鼠皮下觀察其異位成骨的能力。方法:1.兔骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的分離與培養(yǎng):全骨髓貼壁法獲得rBMSCs并培養(yǎng)純化,貼壁細胞達到90%左右時傳代,進行形態(tài)觀察及生長記錄。2.兔成骨細胞的誘導分化:取融合至80%-90%的P2代rBMSCs,更換為成骨誘導液進行誘導成骨,連續(xù)誘導14天后收獲以進行后續(xù)實驗并檢測成骨特性。3.人臍靜脈內(nèi)皮細胞的復蘇與培養(yǎng):將液氮中凍存的人臍靜脈內(nèi)皮細胞取出,水浴復蘇原代細胞,顯微鏡下觀察形態(tài)及生長狀況,傳代培養(yǎng)后用于后續(xù)實驗。4.三維微組織的體外構建:將三維微組織分為兩組,一組為成骨細胞與間充質(zhì)干細胞1:1混合(OB組),以5×10~4個/cm~2的密度接種至96孔低黏附培養(yǎng)板中,隔天換液培養(yǎng)7天;一組為成骨細胞、間充質(zhì)干細胞與人臍靜脈內(nèi)皮細胞1:1:1混合(共培養(yǎng)組),同樣以5×10~4個/cm~2的密度接種至96孔低黏附培養(yǎng)板中,隔天換液培養(yǎng)7天。5.兩組三維微組織植入裸鼠皮下:將每96個微球注射植入一只裸鼠皮下位點,于植入后2周、4周通過大體觀察、HE染色、茜素紅染色、堿性磷酸酶染色及CD31免疫熒光染色等檢測植入微球的成骨能力和成血管能力。結果:1.成功分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細胞,細胞呈長梭形,旋渦狀生長。2.成功誘導兔骨髓間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞,成骨細胞呈多角形或立方形,表面有短突起,茜素紅染色見橙紅色鈣結節(jié)。3.復蘇人臍靜脈內(nèi)皮細胞:人臍靜脈內(nèi)皮細胞復蘇后為P1代,貼壁生長,呈“鋪路石狀“排列。細胞扁平多角形。4.成功構建三維微組織:細胞在96孔低黏附培養(yǎng)板中培養(yǎng)1周,肉眼觀察可見細胞聚集成球狀,兩組茜素紅染色及堿性磷酸酶染色表明兩組微球均有成骨能力,CD31免疫熒光顯示共培養(yǎng)組有成血管潛力。5.植入2周,OB組與共培養(yǎng)組植入位點均發(fā)現(xiàn)組織結節(jié),4周后,兩組植入位點處組織結節(jié)變小,邊界清晰,表面按壓較硬。HE及茜素紅染色發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組較OB組成骨多,CD31染色發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組形成血管數(shù)目遠多于OB組。結論:1.使用低黏附培養(yǎng)板可以比較簡單易操作地形成三維微組織,且其質(zhì)地較為緊密。2.用骨髓間充質(zhì)干細胞、成骨細胞及人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外構建的三維微組織植入裸鼠體內(nèi)后具有成骨成血管的能力。
【圖文】：

約覆蓋培養(yǎng)瓶底部 40%。72 小時后，細胞分裂增殖狀況良好（圖1A），貼壁細胞呈短梭形、多角形，繼續(xù)再培養(yǎng) 2 天，細胞呈集落形生長，形狀變?yōu)殚L梭形，培養(yǎng)至 1 周時，多個細胞集落相互融合，細胞融合約 90%時，傳代培養(yǎng)，24 小時后細胞貼壁，呈長梭形，48 小時后迅速增殖，繼續(xù)培養(yǎng) 3-4 天，細胞再次融合覆蓋瓶底，呈漩渦或平行狀（圖 1B）圖 1 兔骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng) 2 天和 10 天圖注：A 為培養(yǎng) 2 天時由塊狀骨髓爬行生長的兔骨髓間充質(zhì)干細胞；B 為培養(yǎng) 10天時的兔間充質(zhì)干細胞（scale bar=100μm）3.2 兔成骨細胞誘導分化形態(tài)觀察兔骨髓間充質(zhì)干細胞傳代至 P2 代后

圖 1 兔骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng) 2 天和 10 天圖注：A 為培養(yǎng) 2 天時由塊狀骨髓爬行生長的兔骨髓間充質(zhì)干細胞；B 為培養(yǎng) 10天時的兔間充質(zhì)干細胞（scale bar=100μm）3.2 兔成骨細胞誘導分化形態(tài)觀察兔骨髓間充質(zhì)干細胞傳代至 P2 代后，，細胞形態(tài)均勻，呈長梭形（圖 2A），誘導 7 天后，細胞變大變短，表面有細小突起，胞核變大而圓（圖 2B），誘導 14 天后，細胞變?yōu)槎嘟切位蛄⒎叫�，表面短突起與相鄰細胞連接，胞核位于細胞一端（圖 2C）
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R68;R318.08

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本文編號：2692032