【摘要】：微環(huán)境對維持細(xì)胞的活性和功能起到重要作用。作為腎臟的基本結(jié)構(gòu)和功能單元,腎單位具有腎小球?yàn)V過和腎小管重吸收、分泌等功能。由于腎單位特殊的結(jié)構(gòu)和功能,不同種類、不同區(qū)域的細(xì)胞所處的微環(huán)境有較大差異。體外實(shí)驗(yàn)影響因素少、條件可控,在研究腎臟損傷機(jī)制和藥物篩選中占據(jù)重要地位。但現(xiàn)有的二維和三維體外培養(yǎng)平臺仿真度低,難以模擬腎臟復(fù)雜的微環(huán)境。微流控平臺具有流體可控、設(shè)計(jì)組合靈活等優(yōu)點(diǎn),輔以具有生理功能的細(xì)胞與仿生的細(xì)胞排布,有可能構(gòu)建具有相似結(jié)構(gòu)和核心功能的腎芯片。目前已有腎芯片相關(guān)報(bào)道,但現(xiàn)有工作使用的具有功能的細(xì)胞種類少,只模擬了腎單位的部分節(jié)段,不能在一個系統(tǒng)內(nèi)完整實(shí)現(xiàn)物質(zhì)經(jīng)腎小球?yàn)V過、腎小管分泌或重吸收的生理過程,結(jié)構(gòu)和功能的仿真度較差。為探討和驗(yàn)證提高腎芯片仿真度的關(guān)鍵因素,本文首先由簡單到復(fù)雜,分別設(shè)計(jì)并構(gòu)建了單層腎小管上皮細(xì)胞芯片、腎小管管周芯片以及同時具有腎小球單元和腎小管單元的腎單位芯片。其中前兩種芯片能夠初步模擬腎小管相應(yīng)功能,腎單位芯片能夠初步模擬體內(nèi)腎臟中物質(zhì)在結(jié)合態(tài)和游離態(tài)之間的轉(zhuǎn)換、腎小球?yàn)V過、腎小管分泌、腎小管重吸收等四個物質(zhì)經(jīng)腎消除的重要環(huán)節(jié)。隨后對腎單位芯片具有相對完整的結(jié)構(gòu)和功能的必要性進(jìn)行驗(yàn)證,并對腎單位芯片的功能及潛力進(jìn)行探討。論文的第一步部分開發(fā)了構(gòu)建腎單位模型所需細(xì)胞的分離和提取方法。使用該方法可以通過一次實(shí)驗(yàn),從同一只大鼠的腎臟中,同時獲得原代腎足細(xì)胞、腎小管管周血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞。通過比較不同組織獲取方法對細(xì)胞活性的影響,膠原酶的種類和消化時間的選擇對獲取組織的純度和活性的影響,不同包被條件對三種原代細(xì)胞的增殖和功能維持情況的影響,不同培養(yǎng)液成分對腎小管上皮細(xì)胞和足細(xì)胞的活性和功能維持的影響,確定了最優(yōu)分離、培養(yǎng)方案。論文的第二步部分描述了兩種腎小管芯片的構(gòu)建方法,以“夾膜”式為基本結(jié)構(gòu),利用種有腎小管上皮細(xì)胞的多孔膜構(gòu)建單層腎小管上皮細(xì)胞芯片,利用分別種有腎小管管周血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞的多孔膜構(gòu)建腎小管管周芯片。考察了腎小管管周血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞層的致密性和功能;考察了腎小管芯片對于細(xì)胞功能在體外重建的影響;考察了在腎小管芯片中形成細(xì)胞極性對順鉑致?lián)p傷評估結(jié)果的影響;比較了兩種腎小管芯片在順鉑致腎小管損傷評估中的仿真性。與單層腎小管上皮細(xì)胞芯片相比,腎小管管周芯片從結(jié)構(gòu)上以及在順鉑腎毒性評價的表現(xiàn)中都更為接近體內(nèi)情況。論文的第三部分,描述了一種腎單位芯片的構(gòu)建方法。該方法以“夾膜”式為基本結(jié)構(gòu),利用種有大鼠原代腎足細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的多孔膜構(gòu)建腎小球單元,利用種有大鼠原代腎小管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的多孔膜構(gòu)建腎小管單元。腎小球單元具有分子尺寸和電荷選擇性濾過功能,腎小管單元具有對氨基馬尿酸分泌和葡萄糖重吸收功能。在“人工血液”里添加血清白蛋白,促進(jìn)細(xì)胞功能重建。比較了腎單位芯片和單層腎小管上皮細(xì)胞芯片以及腎小管管周芯片在順鉑致腎小管損傷評估中的仿真性。與另兩種腎小管芯片相比,腎單位芯片從結(jié)構(gòu)上以及在順鉑腎毒性評價的表現(xiàn)中都更為接近體內(nèi)情況。論文的第四部分,以藥致腎損傷為例,探討了腎單位芯片的功能及潛力。該芯片可以用于考察不同濃度的順鉑作用下,腎小球單元和腎小管單元細(xì)胞的損傷情況;比較順鉑和阿霉素對腎單位芯片的腎小球單元和腎小管單元細(xì)胞的損傷順序;考察順鉑和阿霉素對腎單位芯片的腎小球單元和腎小管單元細(xì)胞功能蛋白表達(dá)的影響;探討在“人工血液”里添加血清白蛋白對順鉑和阿霉素所致腎損傷的影響。部分?jǐn)?shù)據(jù)與已報(bào)道的體內(nèi)結(jié)果相近,表明腎單位芯片在藥致腎損傷研究中有較大的應(yīng)用潛力。本文設(shè)計(jì)并構(gòu)建的腎單位芯片,初步模擬了體內(nèi)腎臟中藥物在結(jié)合態(tài)和游離態(tài)之間的轉(zhuǎn)換、腎小球?yàn)V過、腎小管分泌、腎小管重吸收等四個對藥物腎毒性的影響較大動態(tài)過程。與現(xiàn)有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺相比,該芯片在結(jié)構(gòu)和功能上具有更高的仿真性。該腎單位芯片可用于體外測試藥物腎毒性,研究腎的功能,特別是腎損傷致病機(jī)制,有望填補(bǔ)現(xiàn)有體外研究缺乏高仿真度模型的空白,成為腎臟疾病研究的有力武器,從而在尋找新的治療靶點(diǎn)及藥物研發(fā)中占據(jù)重要地位。
【圖文】：

邐大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑情由輕到重依次為：０級為亞急性ＡＫＤ，這一等級又被細(xì)致分為，Ａ沒有損傷指征，Ｂ逡逑有預(yù)示損傷的生物標(biāo)志物或腎臟儲備功能減退，Ｃ血清肌酐不能回到正常范圍；１級為逡逑血清肌酐增加了邋１．５倍；２級為血清肌酐增加了邋２倍；３級為血清肌酐增加了邋３倍或需要逡逑腎臟替代治療，即透析或腎移植；４級為需要進(jìn)行不間斷的腎臟替代治療。逡逑ｎｕｒ

邐微流控仿生腎單位芯片的構(gòu)建及功能研究邐逡逑被細(xì)胞貼附的多孔膜，在“人工血液”里加入與體內(nèi)濃度相近的白蛋白，模擬與體內(nèi)相近逡逑的膠體滲透壓�！叭斯ぱ骸痹谘軆�(nèi)皮細(xì)胞側(cè)循環(huán)流動，模擬體內(nèi)循環(huán)，“人工尿液”逡逑在足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞一側(cè)單向流動，，模擬尿液排出方式。最終在物質(zhì)傳遞方式方逡逑面，該腎單位芯片能夠在一定程度上模擬體內(nèi)腎臟中，藥物在結(jié)合態(tài)游離態(tài)之間的轉(zhuǎn)換、逡逑腎小球?yàn)V過、腎小管分泌、腎小管重吸收等四個對藥物腎毒性的影響較大動態(tài)過程。逡逑研究方案如圖１．３所示。逡逑
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 吳國娟;楊明;王典仁;王彥英;沈紅;張中文;;小鼠腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定[J];解剖學(xué)報(bào);2007年06期

本文編號：2690546