【摘要】：目的:研究Ad-TGFβ1感染BMSCs黏附3D打印PLA支架的軟骨細(xì)胞分化性能,為BMSCs-PLA復(fù)合支架進(jìn)行體內(nèi)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1、2月齡新西蘭大白兔缺氧處死,從雙后肢股骨、脛骨中分離出BMSCs培養(yǎng),每2-3天觀察其生長情況,直至培養(yǎng)至第三代細(xì)胞(P3)備用;2、Ad-TGFβ1擴(kuò)增,檢測(cè)擴(kuò)增后Ad-TGFβ1滴度;取擴(kuò)增后的Ad-TGFβ1感染BMSCs細(xì)胞,TGFβ1基因成功導(dǎo)入BMSCs細(xì)胞,同法用Ad-TGFβ1空載體導(dǎo)入BMSCs后備用。第7天時(shí)用熒光顯微鏡在觀察綠色熒光細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算空載組和感染組的感染效率。3、制作兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型,進(jìn)行膝關(guān)節(jié)CT掃描,收集軟骨缺損原始數(shù)據(jù),以PLA為打印材料設(shè)計(jì)支架孔徑100μm,運(yùn)用3D技術(shù)制作軟骨缺損支架,用2mol/L Na OH溶液對(duì)PLA支架進(jìn)行表面改性后。消毒備用。4、取18個(gè)PLA支架,隨機(jī)將其中6個(gè)PLA支架和Ad-TGFβ1感染組BMSCs共培養(yǎng),另隨機(jī)6個(gè)PLA支架和空載組細(xì)胞共培養(yǎng),剩余6個(gè)PLA支架和空白對(duì)照組BMSCs細(xì)胞共培養(yǎng)。每2-3天換液,細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定各組細(xì)胞在PLA支架上的黏附率。5天后掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附情況。CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞在PLA支架上的細(xì)胞活力。取各組支架細(xì)胞復(fù)合物進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo),7天后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)軟骨細(xì)胞分化效果,q PCR檢測(cè)TGFβ1 m RNA的相對(duì)表達(dá)量,Western blot檢測(cè)COL-Ⅱ表達(dá)量;用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料服從正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,三組及三組以上使用方差分析,兩兩對(duì)比使用LSD檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、從兔骨髓組織中成功分離出BMSCs;2、構(gòu)建的Ad-TGFβ1感染HEK293細(xì)胞后出現(xiàn)明顯CEP現(xiàn)象,Ad-TGFβ1病毒滴度檢測(cè)為5xl08PFU/m L。成功將擴(kuò)增后的Ad-TGFβ1感染BMSCs,感染效率高達(dá)80%。3、采用3D打印技術(shù)制備出孔徑大小100μm PLA軟骨缺損支架。4、電鏡掃描示各組PLA支架表面均有細(xì)胞黏附,見有線狀突起伸展貼附于支架上,但BMSCs與PLA支架共培養(yǎng)各組細(xì)胞黏附率差異明顯,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞黏附率最高組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各組支架細(xì)胞復(fù)合物成軟骨誘導(dǎo)第7天進(jìn)行TGFβ1m RNA的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè),轉(zhuǎn)染組TGFβ1m RNA的相對(duì)表達(dá)量為2.28±0.13,顯著高于空白組和空載組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。甲苯胺藍(lán)染色感染組細(xì)胞核呈藍(lán)紫色,空載組及空白組甲苯胺藍(lán)染色陰性。電泳結(jié)果顯示感染組條帶染色深,COL-Ⅱ相對(duì)表達(dá)量為1.40±0.06,較空白組及空載組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、3D打印PLA支架表面改性處理后能夠增強(qiáng)Ad-TGF?1感染BMSCs PLA支架黏附性能。2、Ad-TGF?1感染BMSCs黏附3D打印PLA支架能夠誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞。
【圖文】：

關(guān)節(jié)軟骨缺損模型制作并進(jìn)行 CT 掃描 A：軟骨缺損造模前兔膝關(guān)節(jié)股骨遠(yuǎn)端圖片；B：節(jié)股骨遠(yuǎn)端圖片（直徑 3.5mm 深 2mm ）；C：實(shí)驗(yàn)兔麻醉狀態(tài)下進(jìn)行 CT 掃描；D：兔右軟骨缺損圖像。D 圖中“↑”提示兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。 打印 PLA 支架實(shí)驗(yàn)所用 PLA 長絲（直徑 1.75 mm）及臺(tái)式 3D 打印機(jī)（圖 2）由天公司提供。打印單位為珠海市香洲區(qū)第二人民醫(yī)院，3D 打印基地。文件格式由.stl 文件修改為.gcode 文件。并運(yùn)用 Simple3D 軟件進(jìn) 3）：編輯兔軟骨缺損區(qū)域 CT 三維重建圖像（圖 3A），創(chuàng)建硬組像素，切除剩余的健康骨組織，僅保留軟骨缺損區(qū)域圖像(圖 3B、像內(nèi)進(jìn)行網(wǎng)格填充，填充約 70%，去除頂蓋，打印尺寸為直徑 3.5 m計(jì)出 3D 打印前預(yù)模型(圖 3D）；連接天威 3D 臺(tái)式打印機(jī)進(jìn)行 PLAD 打印噴頭在 210 ℃的固定溫度下擠出 PLA。打印速度控制為精確10 ℃，最終打印出的 PLA 支架大小為直徑 3.5 mm，深 2 mm(圖 3E

學(xué)碩士學(xué)位論文 二0一九年五月 支架表面改性處理：取 PLA 支架置于 2 mol/L NaOH 溶液中，并在恒反應(yīng) 30 min。用蒸餾水清洗 3 次，真空干燥，紫外線消毒滅菌 3
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：2688221