【摘要】：研究背景石墨烯材料是研究人員2004年發(fā)現(xiàn)的新型納米材料,被譽(yù)為“黑金”,在生物材料等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。石墨烯及其主要衍生物氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)和還原型氧化石墨烯(Reduced graphene oxide,rGO)可應(yīng)用于生物成像、藥物和基因載體、組織工程學(xué)等。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,石墨烯材料也有廣闊的應(yīng)用前景。通過使用石墨烯衍生物對種植體和義齒基托改性可極大地改善傳統(tǒng)材料的性能;石墨烯氧化物還可以用作抗菌藥物或細(xì)菌的遠(yuǎn)程檢測。但是,石墨烯家族對人體產(chǎn)生的潛在毒性日益引起關(guān)注,有研究證實(shí),納米級尺寸的石墨烯材料能通過靜脈注射、吸入等多種途徑進(jìn)入機(jī)體,穿過血腦屏障進(jìn)入大腦,并導(dǎo)致神經(jīng)毒性損傷,但具體致病機(jī)制尚不明確。研究目的本研究使用PC12細(xì)胞系建立神經(jīng)元細(xì)胞模型,通過給予GO和rGO處理,探究石墨烯氧化物的細(xì)胞毒性強(qiáng)度;進(jìn)一步探討相同濃度劑量下兩種石墨烯氧化物對細(xì)胞周期改變和凋亡產(chǎn)生的影響及相關(guān)機(jī)制。材料與方法第一章:GO和rGO的表征檢測和細(xì)胞毒性作用1.原子力顯微鏡(Atomic force microscopy,AFM)檢測GO和rGO的原始粒徑和形態(tài)。拉曼光譜表征石墨烯材料的缺陷(D峰)、sp2碳原子的面內(nèi)振動(G峰)和碳原子堆垛方式(G'峰)。動態(tài)光散射(Dynamic light scattering,DLS)檢測納米顆粒在混懸液中的水合粒徑和Zeta電位。2.使用神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)元樣改變,建立神經(jīng)元模型。不同濃度的GO或rGO處理細(xì)胞后,使用CCK-8毒性-增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率;使用乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放檢測試劑盒檢測細(xì)胞上清中LDH的釋放量和活性。第二章:GO和rGO誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯1.使用凋亡檢測試劑盒檢測GO和rGO對PC12細(xì)胞凋亡、壞死的影響。2.使用細(xì)胞周期檢測試劑盒檢測GO和rGO對PC12細(xì)胞周期的阻滯效應(yīng);使用免疫熒光法觀察細(xì)胞分裂改變。第三章:GO和rGO誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的相關(guān)機(jī)制研究1.使用透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)改變;流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化;ATP檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ATP含量,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ROS生成量。2.使用免疫熒光法觀察GO和rGO對PC 12細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架系統(tǒng)的影響。3.提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后實(shí)時熒光定量PCR(Quantitativereal-time PCR,qPCR)檢測凋亡及細(xì)胞骨架相關(guān)基因的表達(dá)變化。4.使用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot)檢測GO和rGO干預(yù)對PC12細(xì)胞內(nèi)骨架相關(guān)蛋白和ERK信號通路蛋白磷酸化水平的影響。結(jié)果1.AFM檢測得本實(shí)驗(yàn)選用的GO和rGO為不規(guī)則片狀、厚度在1 nm以內(nèi)的納米材料;拉曼光譜檢測到GO和rGO特征峰:G峰、D峰、G'峰;DLS結(jié)果顯示GO平均粒徑為219 nm,Zeta電位為-14.3±11.1 mV,rGO平均粒徑是122.4 nm,Zeta 電位為-17.7±7.99 mV。2.成功誘導(dǎo)并建立PC12神經(jīng)元模型。GO和rGO在相同濃度梯度下表現(xiàn)出不同的細(xì)胞毒性效應(yīng),并能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)LDH釋放到細(xì)胞外。3.高濃度的GO和rGO能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡壞死、細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期、抑制細(xì)胞分裂。4.GO和rGO能損傷線粒體結(jié)構(gòu)與功能,以及調(diào)控細(xì)胞內(nèi)線粒體介導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化。5.GO和rGO能損傷細(xì)胞內(nèi)微管、微絲系統(tǒng),并調(diào)控細(xì)胞內(nèi)微管、微絲相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化。6.GO和rGO能調(diào)控ERK信號通路磷酸化水平。抑制ERK通路能一定程度的逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡水平和細(xì)胞周期阻滯。結(jié)論GO和rGO能誘導(dǎo)PC12產(chǎn)生細(xì)胞毒性、釋放LDH、細(xì)胞凋亡及壞死、細(xì)胞周期阻滯和抑制細(xì)胞分裂。其中,GO和rGO激活的線粒體損傷可能參與調(diào)控細(xì)胞凋亡壞死。GO和rGO誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架系統(tǒng)損傷影響細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂改變。ERK通路參與調(diào)控GO和rGO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和周期阻滯。
【圖文】：

隨著干預(yù)時間延長，偽足逐漸伸長，最終多個細(xì)胞之間偽足形成交叉連接。當(dāng)使逡逑用ＮＧＦ刺激誘導(dǎo)至第１０ｄ，幾乎所有細(xì)胞均出現(xiàn)偽足，刺激誘導(dǎo)至第１４邋ｄ，，己逡逑具有明顯的神經(jīng)元樣形態(tài)（圖１－２）。逡逑１．２．３邐ＧＯ和ｒＧ（）對ＰＣ１２細(xì)胞的增殖－毒性檢測逡逑通過ＣＣＫ－８細(xì)胞增殖－毒性檢測實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)檢測了梯度濃度的ＧＯ和１－ＧＯ逡逑對ＰＣ１２細(xì)胞存活率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖１－３）發(fā)現(xiàn)ＧＯ和ｒＧＯ均對ＰＣ１２細(xì)逡逑Ｏｄ邐３ｄ邐５ｄ逡逑＾邋．邋．，ｋ邐－邋％：，邐．邋－邋ｍ逡逑７ｄ邐ｌＯｄ邐１４ｄ逡逑柋．＇邋．觀遍邋Ｉ１Ｐ＿逡逑．．，，’事、＇，．逡逑圖１－２．邋ＮＧＦ誘導(dǎo)ＰＣ］２細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞（ｘ４００）逡逑對未分化ＰＣ１２細(xì)胞進(jìn)行ＮＧＦ誘導(dǎo)，成功誘導(dǎo)出具有神經(jīng)元表型的細(xì)胞。逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２．邋ＮＧＦ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＰＣ１２邋ｃｅｌｌ邋ｌｉｎｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋（ｘ４００）逡逑Ｗｅ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＰＣ邋１２邋ｃｅｌｌ邋ｌｉｎｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｉｎ邋ｗｉｔｈ邋ＮＧＦ，邋ｔｈｅ邋ｎｅｕｒｏｎ－ｌｉｋｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｄｕｒｉｎｇ逡逑ｔｈｅ邋２邋ｗｅｅｋｓ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．逡逑１０逡逑

第二章：氧化石墨烯和還原型氧化石墨烯對ＰＣ１２細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響逡逑制了細(xì)胞的正常增殖。細(xì)胞增殖需要細(xì)胞周期的正常運(yùn)行。因此，為進(jìn)一步明確逡逑Ｇ？和ｒＧＯ對ＰＣ］２細(xì)胞毒性與增殖抑制，本實(shí)驗(yàn)選擇不同濃度的ＧＯ和ｒＧＯ干逡逑預(yù)處理ＰＣ１２細(xì)胞并檢測細(xì)胞周期改變。結(jié)果（圖２－２）顯示，ＧＯ和ｒＧＯ主要逡逑造成ＰＣ１２細(xì)胞周期阻滯在Ｇ０／Ｇ１期，且阻滯效應(yīng)與處理濃度呈正相關(guān)。其中，逡逑低濃度（１０邋ｐｇ／ｍＬ）的ＧＯ和ｒＧＯ并未明顯阻滯ＰＣ邋１２進(jìn)入Ｓ期。隨著ＧＯ的濃逡逑度增加至２０和５０｜＿ｉｇ／ｍＬ，處于Ｇ０／Ｇ１期的細(xì)胞比率增多，且Ｇ２／Ｍ期細(xì)胞比率逡逑也減少。ｒＧＯ的濃度增加也使得處于Ｇ０／Ｇ１期的細(xì)胞比率增多，但是不同濃度逡逑處理組進(jìn)入Ｇ２／Ｍ期的細(xì)胞比率并沒有明顯差異。逡逑入邋ＧＯ逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

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