【摘要】：研究目的與背景:皮下軟組織缺損雖不是特別棘手的臨床問題,但卻因其在臨床上尤為常見,一直困擾著臨床醫(yī)生,據(jù)美國(guó)整形外科協(xié)會(huì)報(bào)道,僅2015年一年修復(fù)重建類手術(shù)便有逾580萬(wàn)例。傳統(tǒng)治療手段經(jīng)常是“拆東補(bǔ)西”,造成供體部位局域的組織畸形、感染和移植組織不存活等問題。組織工程學(xué)是最有前景的方法。組織工程構(gòu)架中必不可少的三要素之一就是組織工程支架,并且,理想的支架材料應(yīng)具有一定三維結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的功能。本研究主旨在深入探討和研發(fā)新型組織工程支架用于皮下軟組織缺損的修復(fù)。因豬小腸粘膜下層(Porcine small intestinal submucosa,P-SIS)的脫細(xì)胞基質(zhì)具有很好的組織相容性和生物活性,且豬小腸粘膜下層易于獲得,成本較低,來源充足,本課題組前期制備了P-SIS的冷凍凝膠等材料,可用于皮下軟組織缺損的修復(fù),然而P-SIS的降解時(shí)間較快,或用化學(xué)交聯(lián)的方法延長(zhǎng)其降解時(shí)間,這種方法容易發(fā)生化學(xué)交聯(lián)劑殘留,影響細(xì)胞存活。隨著材料學(xué)的發(fā)展和深入研究,越來越多的生物可降解聚合物被用于醫(yī)療領(lǐng)域,聚對(duì)二氧環(huán)己酮(poly(p-dioxanone),PPDO)是脂肪族聚酯的一種,由于它的分子鏈上含有醚鍵,所以具有良好柔韌性、較強(qiáng)抗張強(qiáng)度、高打結(jié)強(qiáng)度等特點(diǎn)。在上世紀(jì)70年代后期被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于外科縫合線材料,除上述特點(diǎn),還具備降解時(shí)間緩慢,其降解產(chǎn)物與人體代謝產(chǎn)物一致,可完全被排出體外等優(yōu)點(diǎn)。然而,其親水性不好導(dǎo)致加工困難,并限制了它的開發(fā)與應(yīng)用。因此本課采用了細(xì)胞外基質(zhì)P-SIS和生物可降解PPDO為基材,制備了一種新型三維多孔支架材料,不僅具備細(xì)胞外基質(zhì)的特性,還具備降解緩慢、拉伸強(qiáng)度高的特性,適合用做皮下軟組織缺損的修復(fù)。研究方法:第一部分:脫細(xì)胞基質(zhì)的制備、相關(guān)性能檢測(cè)及脫細(xì)胞基質(zhì)的選擇1.豬心包膜脫細(xì)胞基質(zhì)膜(P-PC)和豬小腸粘膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)膜(P-SIS)的制備以及相關(guān)檢測(cè),包括:DNA殘留檢測(cè)提取與鑒定有無(wú)細(xì)胞殘留,外觀特征大體觀察,掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu),力學(xué)性能分析等;2.根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及文獻(xiàn)檢索進(jìn)行綜合性分析,針對(duì)本課題需求,最終選擇了P-SIS作為本課題復(fù)合支架的天然生物基質(zhì)成分;3.P-SIS粉末的制備。第二部分:PPDO-SIS復(fù)合多孔支架的制備1.PPDO溶解實(shí)驗(yàn),PPDO難溶于一般有機(jī)溶劑,故找到一種合適的有機(jī)溶劑用于復(fù)合材料的制備是必要的;2.PPDO成膜實(shí)驗(yàn);3.PPDO-SIS復(fù)合支架的制備;4.PPDO-SIS復(fù)合支架的表征與微觀結(jié)構(gòu),并與PPDO膜進(jìn)行對(duì)照分析;5.PPDO-SIS復(fù)合支架的成分特征檢測(cè)(采用傅里葉紅外光譜分析FTIR和X射線衍射圖譜分析XRD),并與P-SIS膜和PPDO膜進(jìn)行對(duì)照分析;6.PPDO-SIS復(fù)合支架的力學(xué)性能檢測(cè)(對(duì)照組同上);7.PPDO-SIS復(fù)合支架的熱重分析(對(duì)照組同上);8.PPDO-SIS復(fù)合支架在58℃的蛋白酶K溶液中和37℃的磷酸鹽緩沖液PBS中的降解率測(cè)定(對(duì)照組同上);9.PPDO-SIS復(fù)合支架的吸水性檢測(cè)(對(duì)照組同上)。第三部分:PPDO-SIS復(fù)合多孔支架的體外生物學(xué)觀察1.綠色熒光轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)的分離培養(yǎng);2.PPDO-SIS支架材料與ADSCs的體外復(fù)合培養(yǎng);3.CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性與增殖(P-SIS膜、PPDO膜為對(duì)照組);4.掃描電鏡(SEM)觀察細(xì)胞狀態(tài)。第四部分:PPDO-SIS復(fù)合多孔支架的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察1.制作小鼠皮下軟組織缺損模型,實(shí)驗(yàn)分四個(gè)組:P-SIS膜組、PPDO-SIS復(fù)合支架組、PPDO膜組和空白對(duì)照組,將P-SIS膜、PPDO-SIS復(fù)合支架、PPDO膜分別埋置在小鼠皮下,觀察各組材料對(duì)皮下軟組織缺損的修復(fù)作用。2.通過組織切片的HE染色、免疫熒光檢測(cè)CD34和免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組材料中CD90表達(dá)和Western blot檢測(cè)CD31和VEGF表達(dá)情況,觀察分析PPDO-SIS復(fù)合支架移植后的局部促血管化和細(xì)胞增殖情況。研究結(jié)果:1.制備出脫細(xì)胞的P-PC膜、P-SIS膜和P-SIS粉末。P-SIS粉末更利于復(fù)合支架的制備工藝要求。2.成功制備出PPDO-SIS復(fù)合支架。該支架經(jīng)SEM觀察,具有三維多孔結(jié)構(gòu),孔壁有微孔,在材料內(nèi)部可實(shí)現(xiàn)互通。PPDO-SIS復(fù)合支架材料具有良好的吸水性能,與生物基質(zhì)P-SIS膜相比,比P-SIS膜的吸水性稍高,與高分子聚合物PPDO膜相比,其吸水性能遠(yuǎn)高于高分子PPDO膜,且具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。FTIR檢測(cè)PPDO-SIS復(fù)合支架顯示波數(shù)為1736cm~(-1)的C=O伸縮振動(dòng)吸收峰,在1221cm~(-1)、1126cm~(-1)、1052cm~(-1)顯示了C-O伸縮振動(dòng)峰,說明共混后的PPDO-SIS復(fù)合支架依然保有PPDO的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征。XRD結(jié)果顯示PPDO-SIS復(fù)合支架的X射線衍射峰主要出現(xiàn)在2θ角為21.92°、23.78°和29.12°,證實(shí)了P-SIS的混入對(duì)PPDO-SIS復(fù)合材料的晶體類型并沒有影響,依舊顯示的是PPDO的特征衍射峰。PPDO-SIS復(fù)合支架的應(yīng)變率較P-SIS膜有所增加,可以滿足皮下軟組織缺損修復(fù)的力學(xué)要求。在蛋白酶K溶液中,48小時(shí)P-SIS的降解率高達(dá)近85%,PPDO-SIS復(fù)合支架約為10%,PPDO膜的降解率不到1%,通過統(tǒng)計(jì)分析得出,PPDO-SIS復(fù)合支架和P-SIS膜的降解率始終都有極為顯著差異(P0.01%),和PPDO膜在12h時(shí)的降解率開始存在顯著差異(P0.05%),隨著降解時(shí)間的增加,這種差異趨于更為顯著(P0.01%),這和PPDO-SIS復(fù)合支架中含有P-SIS成分有很大關(guān)系。PBS緩沖液中體外降解率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,雖然PPDO-SIS復(fù)合支架材料與PPDO膜在四個(gè)時(shí)間觀察點(diǎn)(1w、2w、3w、4w)的降解速率均存在極為顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01%),但是,PPDO-SIS復(fù)合支架在4w時(shí)的降解率也僅為25%。PPDO-SIS復(fù)合支架材料具有良好的吸水性能,比P-SIS膜稍高,與PPDO膜相比,其吸水性能遠(yuǎn)比高分子PPDO膜要高,且具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察結(jié)果可見帶有綠色熒光的ADSCs細(xì)胞在P-SIS膜、PPDO-S復(fù)合支架材料以及PPDO膜上均能廣泛分布生長(zhǎng),通過掃描電子顯微鏡可以清晰的看到細(xì)胞形態(tài)呈梭形,伸展良好,特別是可見ADSCs在PPDO-SIS復(fù)合支架的孔壁上生長(zhǎng)。通過CCK-8試劑盒測(cè)試出的24h PPDO-SIS復(fù)合支架與PPDO膜存在著顯著差異(P0.05)。測(cè)出第1d、3d、5d、7d的CCK-8吸光度顯示了各組材料的細(xì)胞增殖情況,P-SIS膜的細(xì)胞增殖最好,PPDO-SIS復(fù)合支架也較好,PPDO膜最差,但隨著時(shí)間的推移,PPDO-SIS復(fù)合支架的細(xì)胞增殖與P-SIS膜的細(xì)胞增殖情況從極為顯著差異(P0.01)轉(zhuǎn)變?yōu)轱@著差異(P0.05),然而,PPDO膜與PPDO-SIS復(fù)合支架在任何時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)均存在極為顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。4.不同支架材料埋置于小鼠的皮下軟組織缺損部位,結(jié)果顯示,P-SIS膜、PPDO-SIS復(fù)合支架、PPDO膜在小鼠體內(nèi)均具有良好的組織相容性,都可以很好的生長(zhǎng),但在2周時(shí),P-SIS就已經(jīng)吸收的無(wú)定態(tài)形狀,而PPDO-SIS復(fù)合支架仍保持原有的方形,在4周時(shí)仍能觀察PPDO-SIS復(fù)合支架組和PPDO膜組仍分別有(0.57+0.06)cm和(0.55+0.07)cm,兩者在剩余大小上沒有顯著差別�？瞻讓�(duì)照組在2周和4周時(shí),小鼠背部仍能明顯可以觀察到皮下軟組織缺損的凹陷。2周和4周的HE染色組織病理形態(tài),各材料組均可見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),P-SIS膜組和PPDO-SIS復(fù)合支架組更為明顯。未能觀察到P-SIS膜的殘留,證實(shí)了P-SIS在體內(nèi)吸收較快,另外,PPDO-SIS復(fù)合支架的孔壁可見細(xì)胞聚集,在4周時(shí),各材料組均可見明顯新生血管。CD34免疫熒光染色結(jié)果顯示,P-SIS膜組、PPDO-SIS復(fù)合支架組和PPDO膜組均有CD34的陽(yáng)性表達(dá),并與空白對(duì)照組均有顯著差異(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示PPDO-SIS復(fù)合支架的CD90表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(P0.05)。CD31和VEGF的Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示不同材料均明顯高于空白組(P0.05)。結(jié)論:1.成功制備出的PPDO-SIS復(fù)合支架具有良好的三維多孔結(jié)構(gòu),理化性能符合組織工程支架要求。2.PPDO-SIS復(fù)合支架與ADSCs的體外復(fù)合培養(yǎng)證實(shí)PPDO-SIS復(fù)合支架具有良好的促細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖作用,可用于體內(nèi)移植。3.PPDO-SIS復(fù)合支架材料體內(nèi)降解緩慢,在空間上能起到占位性修復(fù)作用,支架可有效促進(jìn)移植部位的血管化,利于細(xì)胞再生,可有效解決皮下軟組織缺損的修復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2670812