【摘要】：心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見病,世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示全球范圍內(nèi)每年有一千多萬人死于心血管疾病,占死亡總?cè)藬?shù)的30%,心血管疾病已是全球第一致殘致死疾病。我國2016年心血管疾病報(bào)告指出中國心血管疾病患者數(shù)量呈持續(xù)上升趨勢,其死亡率高于腫瘤等其他疾病,居于首位。即使應(yīng)用目前最先進(jìn)、完善的治療手段,仍有50%以上的心血管疾病幸存者生活不能完全自理。導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生的主要原因是血管動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)引起的動(dòng)脈梗阻或狹窄,因此深入研究動(dòng)脈粥樣硬化的形成機(jī)制對(duì)提高心血管疾病的防治具有至關(guān)重要的意義。動(dòng)脈粥樣硬化是一種高度偏好性的血管疾病,它多發(fā)于動(dòng)脈血管彎曲與分叉位置,這些位置多為血流流場紊亂的低震蕩切應(yīng)力區(qū)域,這說明動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展與血流動(dòng)力學(xué)因素密切相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)血流流場紊亂引發(fā)的血管壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變是導(dǎo)致AS形成的重要因素。血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)攝取過多會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)膜下沉積,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成,故內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝取量在AS形成中也起著至關(guān)重要的作用。有研究顯示血管壁脂質(zhì)沉積與血流流速及切應(yīng)力可能存在相關(guān)性,但其具體的調(diào)控機(jī)制并不清楚,所以本研究以低震蕩切應(yīng)力為主線,研究其對(duì)血管內(nèi)脂質(zhì)攝取及沉積的影響及相關(guān)分子機(jī)制,這將有助于解析切應(yīng)力影響AS發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制,并且有可能為AS的治療提供潛在的新靶點(diǎn)。在本課題研究中,通過對(duì)Apo E~(-/-)小鼠頸總動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎手術(shù)構(gòu)建了小鼠低震蕩切應(yīng)力模型,并通過小動(dòng)物超聲檢測其血流狀態(tài)以確保模型構(gòu)建成功。通過蛋白組學(xué)方法檢測了低震蕩切應(yīng)力與層流切應(yīng)力下血管組織蛋白的差異表達(dá)情況,并進(jìn)行了相關(guān)信號(hào)通路分析,發(fā)現(xiàn)低震蕩切應(yīng)力可能通過影響脂質(zhì)吸收及炎癥反應(yīng)等過程影響AS的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步構(gòu)建Apo E~(-/-)小鼠低震蕩切應(yīng)力模型檢測其血管內(nèi)斑塊形成、脂質(zhì)堆積、內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)吸收等情況,并通過在體及體外實(shí)驗(yàn)研究了Id1蛋白在低震蕩切應(yīng)力引起的脂質(zhì)吸收過程中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:1.構(gòu)建Apo E~(-/-)小鼠頸動(dòng)脈低震蕩切應(yīng)力模型,并通過小動(dòng)物超聲方法檢測其頸動(dòng)脈血流流速,結(jié)果顯示對(duì)左頸動(dòng)脈分支進(jìn)行結(jié)扎后,左頸總動(dòng)脈血管內(nèi)血流流速降低并且出現(xiàn)兩個(gè)呈相反方向的血流,此時(shí)血管內(nèi)的切應(yīng)力為往復(fù)的低震蕩切應(yīng)力,而對(duì)側(cè)進(jìn)行假手術(shù)的右頸總動(dòng)脈血管內(nèi)為單一方向的血流,血管內(nèi)的切應(yīng)力為層流切應(yīng)力。分別提取了兩側(cè)頸動(dòng)脈血管的總蛋白,通過iTRAQ方法檢測層流切應(yīng)力及低震蕩切應(yīng)力下血管差異蛋白表達(dá)譜,結(jié)果顯示相對(duì)于層流切應(yīng)力,低震蕩切應(yīng)力下有168個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中150個(gè)蛋白上調(diào),18個(gè)蛋白下調(diào)。通過GO富集分析及KEGG信號(hào)通路分析方法對(duì)這些蛋白的功能及涉及的信號(hào)通路進(jìn)行分類及預(yù)測,結(jié)果顯示這些差異蛋白與大分子代謝和運(yùn)輸過程、脂肪消化及吸收過程以及炎癥反應(yīng)等密切相關(guān),暗示低震蕩切應(yīng)力可能通過調(diào)控這些過程影響AS的形成。由于脂質(zhì)代謝異常與AS發(fā)生密切相關(guān),所以我們后續(xù)將進(jìn)一步通過在體及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證低震蕩切應(yīng)力是否可以影響血管內(nèi)的脂質(zhì)沉積吸收從而促進(jìn)斑塊形成。2.對(duì)Apo E~(-/-)小鼠頸動(dòng)脈低震蕩切應(yīng)力模型進(jìn)行血漿脂蛋白檢測,發(fā)現(xiàn)手術(shù)形成的低震蕩切應(yīng)力對(duì)小鼠血液中的脂蛋白含量沒有明顯的影響。通過對(duì)小鼠左頸及右頸動(dòng)脈血管組織進(jìn)行HE染色后發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加,進(jìn)行了結(jié)扎手術(shù)的左頸總動(dòng)脈血管(低震蕩切應(yīng)力)內(nèi)膜逐漸增厚,到第10周時(shí)AS斑塊幾乎堵塞整個(gè)血管,而對(duì)側(cè)右頸動(dòng)脈(層流切應(yīng)力)以及對(duì)照組血管(層流切應(yīng)力)內(nèi)膜厚度沒有明顯變化。對(duì)頸總動(dòng)脈血管進(jìn)行油紅O染色后發(fā)現(xiàn)低震蕩切應(yīng)力可以促進(jìn)血管壁脂質(zhì)堆積,并且隨著結(jié)扎時(shí)間的增加,脂質(zhì)堆積越來越嚴(yán)重。對(duì)頸總動(dòng)脈血管組織切片進(jìn)行CD31及BODIPY熒光染色檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞中的脂質(zhì)吸收情況,結(jié)果顯示進(jìn)行結(jié)扎手術(shù)后的左頸總動(dòng)脈(低震蕩切應(yīng)力)內(nèi)皮細(xì)胞吸收的脂質(zhì)明顯高于對(duì)側(cè)的右頸動(dòng)脈(層流切應(yīng)力)及對(duì)照組頸總動(dòng)脈(層流切應(yīng)力)內(nèi)皮細(xì)胞,并且隨著結(jié)扎時(shí)間的延長,低震蕩切應(yīng)力組的血管內(nèi)皮細(xì)胞吸收的脂質(zhì)也越來越多。對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)進(jìn)行力學(xué)加載后檢測其脂質(zhì)吸收情況,結(jié)果顯示低震蕩切應(yīng)力能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的吸收,這與在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。將力學(xué)處理及LDL吸收后的細(xì)胞與THP-1細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)低震蕩切應(yīng)力處理及隨后的LDL吸收可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與THP-1細(xì)胞的粘附,而Ki67免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)說明低震蕩切應(yīng)力處理及隨后的LDL吸收可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。低震蕩切應(yīng)力及隨后的LDL吸收引起的內(nèi)皮細(xì)胞增殖及炎癥反應(yīng)可能參與了AS形成過程。3.我們實(shí)驗(yàn)室已有研究暗示分化抑制因子1(Id1)蛋白是力學(xué)敏感的轉(zhuǎn)錄因子并且與脂質(zhì)代謝過程密切相關(guān),所以我們以Id1為研究對(duì)象,分析其是否參與了OSS調(diào)控的脂質(zhì)吸收過程。對(duì)結(jié)扎24小時(shí)及48小時(shí)的小鼠頸動(dòng)脈進(jìn)行en face染色檢測Id1蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況,我們發(fā)現(xiàn)低震蕩切應(yīng)力抑制Id1蛋白的表達(dá)。對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外力學(xué)加載后,Western blot檢測Id1蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示層流切應(yīng)力促進(jìn)Id1蛋白的表達(dá),并且隨著加載時(shí)間的延長,蛋白表達(dá)量也逐漸增加,到第12小時(shí)表達(dá)量達(dá)到頂峰,而低震蕩切應(yīng)力下,Id1蛋白表達(dá)瞬間增加,但隨著加載時(shí)間的延長,Id1蛋白的表達(dá)最終受到抑制。對(duì)Id1過表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行體外力學(xué)加載并檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)吸收情況,結(jié)果顯示Id1過表達(dá)能夠抑制低震蕩切應(yīng)力調(diào)控的脂質(zhì)吸收過程。4.為了解析Id1通過何種機(jī)制參與低震蕩切應(yīng)力調(diào)控的脂質(zhì)吸收過程,我們使用IPA軟件進(jìn)行了相關(guān)預(yù)測分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AS形成過程中,Id1調(diào)控了許多炎癥因子,如NF-κB、TNF、ICAM等的表達(dá),此外,Id1還與脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白關(guān)系密切,可能調(diào)控了低密度脂蛋白受體LDLR的表達(dá)�；诖�,我們通過在體及體外實(shí)驗(yàn)研究了Id1是否會(huì)通過調(diào)控LDLR的表達(dá)影響細(xì)胞脂質(zhì)吸收過程。對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的Id1蛋白進(jìn)行過表達(dá)及干擾處理后檢測LDLR的蛋白水平,發(fā)現(xiàn)Id1過表達(dá)后LDLR蛋白表達(dá)被抑制,細(xì)胞脂質(zhì)吸收降低;而Id1被干擾后LDLR蛋白表達(dá)明顯增加,細(xì)胞脂質(zhì)吸收也顯著增加。同時(shí)干擾Id1及LDLR后,Id1干擾導(dǎo)致的脂質(zhì)吸收被抑制,這說明Id1異常表達(dá)導(dǎo)致的脂質(zhì)吸收變化是通過調(diào)控LDLR蛋白實(shí)現(xiàn)的。在體en face染色及體外Western blot檢測了層流切應(yīng)力及低震蕩切應(yīng)力下LDLR的表達(dá)情況,結(jié)果顯示低震蕩切應(yīng)力促進(jìn)LDLR蛋白表達(dá),體外結(jié)果發(fā)現(xiàn)層流切應(yīng)力下LDLR表達(dá)瞬間增加,但隨著加載時(shí)間的延長,其表達(dá)則被抑制,而低震蕩切應(yīng)力可以持續(xù)激活LDLR蛋白的表達(dá)。將LDLR干擾后,低震蕩切應(yīng)力誘導(dǎo)的脂質(zhì)吸收被抑制,說明低震蕩切應(yīng)力通過調(diào)控LDLR的表達(dá)影響細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的吸收。體外免疫熒光及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測了LDLR及Id1的表達(dá)模式,與靜態(tài)相比力學(xué)加載24小時(shí)后,層流切應(yīng)力促進(jìn)Id1的表達(dá)而抑制LDLR的表達(dá);相反,低震蕩切應(yīng)力抑制Id1的表達(dá)而促進(jìn)LDLR的表達(dá),說明Id1及LDLR均受到低震蕩切應(yīng)力調(diào)控,且呈負(fù)相關(guān)趨勢。對(duì)Id1過表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行力學(xué)加載后,檢測細(xì)胞內(nèi)LDLR的表達(dá)情況,結(jié)果顯示Id1過表達(dá)抑制了低震蕩震蕩切應(yīng)力對(duì)LDLR的促進(jìn)作用,說明Id1參與了低震蕩切應(yīng)力對(duì)LDLR的調(diào)控過程。由于Id1蛋白需要通過與b-HLH蛋白相結(jié)合才能起作用,所以我們檢測了調(diào)控LDLR表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子SREBP1(屬于b-HLH蛋白家族成員)與Id1的關(guān)系,Western blot結(jié)果顯示Id1過表達(dá)及干擾細(xì)胞中SREBP1的蛋白表達(dá)沒有明顯變化,而免疫共沉淀及熒光共定位結(jié)果顯示Id1與SREBP1存在物理上的結(jié)合,這種物理的結(jié)合可能參與了Id1對(duì)LDLR的調(diào)控過程。綜上所述,本研究綜合運(yùn)用蛋白組學(xué)、生物力學(xué)、病理生理學(xué)、細(xì)胞分子生物學(xué)等方法,通過構(gòu)建小鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎模型,研究低震蕩切應(yīng)力對(duì)血管脂質(zhì)沉積、脂質(zhì)吸收及斑塊形成的影響,同時(shí)結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)研究了OSS引起的脂質(zhì)吸收過程中Id1蛋白的作用。本研究工作一定程度上闡明了Id1參與低震蕩切應(yīng)力調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)吸收的分子機(jī)制,這將為深入了解和認(rèn)識(shí)AS易發(fā)生在血管低震蕩切應(yīng)力區(qū)域提供一些新的科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

：鈍性分離氣管左側(cè)肌肉，找到左動(dòng)脈伴行的迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)，LCA），沿著頸總動(dòng)脈直到找到 ，ECA），頸內(nèi)動(dòng)脈（Internal caroA）和甲狀腺上動(dòng)脈（Superior thyr剖的時(shí)候要非常小心。用 9-0 縫線結(jié)甲狀腺上動(dòng)脈（如圖 2.1 所示），右行分離并找到 4 個(gè)分支血管，但不中，左側(cè)及右側(cè)頸動(dòng)脈都只進(jìn)行分2 萬單位的慶大霉素注射液沖洗，，逐碘在切口處消毒；鼠放在加熱室保暖，直到蘇醒，避

圖 2.2 結(jié)扎模型手術(shù)后 48 小時(shí)可以誘導(dǎo)低震蕩切應(yīng)力形成。（A）結(jié)扎 48 小時(shí)后，通動(dòng)物超聲檢測右頸動(dòng)脈（RCA）及左頸動(dòng)脈（LCA）血管內(nèi)血液情況。（B）統(tǒng)計(jì)分析 RC及 LCA 的血流流速大小（n=3）。**p<0.001 表示與 RCA 相比有顯著差異。Fig 2.2 Theligation model can be induced OSS 48 hours later after partial ligated. (A)Ultrasonography was used to detect the right and left carotid artery blood flow velocities 48 hourafter building the model. (B) Quantitative analysis the velocities of RCA and LCA (n=3).**p<0.001vs the RCA controls.2.3.2 不同力學(xué)條件下的血管組織蛋白樣品制備為了研究不同力學(xué)情況下血管組織蛋白組差異情況，我們將小鼠血管分成：LCA 組和 RCA 組。通過小動(dòng)物超聲確定結(jié)扎血管 48 小時(shí)后 LCA 可以形成蕩切應(yīng)力（OSS），而 RCA 為層流切應(yīng)力（LSS）。我們分別將手術(shù)后 48 小小鼠左頸及右頸總動(dòng)脈進(jìn)行分離提取蛋白，并將樣品送于華大基因公司使用素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（Isobaric tags for relative and absolute quantificationTRAQ）方法進(jìn)行蛋白質(zhì)組差異分析及鑒定。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.01;R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2667356