【摘要】：目的:本研究旨在制備一種細(xì)胞復(fù)合型溫敏性可注射生物活性水凝膠材料,并檢測(cè)其生物學(xué)性能,初步探究其用于軟骨組織再生的可能性。方法:1分別采用全骨髓貼壁法和酶消化法體外分離培養(yǎng)BMSCs與CHs,并對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)鑒定,然后進(jìn)一步聯(lián)合培養(yǎng)獲得CHs-BMSCs;2采用0.4%瓊脂糖、10%明膠和10 mg/ml HA分別與0、1.0%、2.0%和3.0%(w/v)的松質(zhì)骨ECM制備四種溫敏性可注射生物活性水凝膠;3通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡觀察四組溫敏性水凝膠的超微結(jié)構(gòu);進(jìn)一步,分別檢測(cè)四組溫敏性水凝膠平衡溶脹率、生物力學(xué)強(qiáng)度和體外降解率,對(duì)其進(jìn)行體外表征的對(duì)比研究;4體外實(shí)驗(yàn)觀察CHs-BMSCs在溫敏性瓊脂糖/明膠/HA/ECM水凝膠中的生長(zhǎng)情況;5構(gòu)建負(fù)載CHs-BMSCs的復(fù)合型溫敏性水凝膠,通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)該水凝膠復(fù)合體系在大鼠皮下的軟骨再生能力。結(jié)果:(1)我們成功獲得了高純度的P3代大鼠BMSCs和狀態(tài)良好的P1代大鼠CHs,經(jīng)過(guò)兩周共培養(yǎng)后,成功獲得高質(zhì)量的誘導(dǎo)分化的軟骨樣細(xì)胞;(2)我們成功制備了四組溫敏性水凝膠:瓊脂糖/明膠/HA/ECM水凝膠組(S1:ECM 0,w/v),瓊脂糖/明膠/HA/ECM水凝膠組(S2:ECM 1.0%,w/v),瓊脂糖/明膠/HA/ECM水凝膠組(S3:ECM 2.0%,w/v)和瓊脂糖/明膠/HA/ECM水凝膠組(S4:ECM 3.0%,w/v);(3)體外表征結(jié)果表明,S3組水凝膠具有良好的三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu),孔徑大小適宜,適合細(xì)胞的增殖和遷移;ECM顆粒分布均勻,2.0%w/v ECM顆粒的添加明顯改善了水凝膠的平衡溶脹能力、生物力學(xué)強(qiáng)度和體外降解能力;(4)S3組水凝膠復(fù)合CHs-BMSCs體外共培養(yǎng)1,3和7天,細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好,平均細(xì)胞存活率均在90%以上,表明其細(xì)胞相容性良好。(5)體內(nèi)給藥部位大體解剖和組織學(xué)結(jié)果顯示,S1組和S3組水凝膠皮下給藥后均可在局部形成獨(dú)立的半球型淡黃色包塊,S3組水凝膠的包塊結(jié)構(gòu)更完整,表面更整體光滑,質(zhì)地更柔韌,鏡下可見(jiàn)排列較整齊的纖維包裹的細(xì)胞群和膠狀基質(zhì)團(tuán)塊,細(xì)胞群中有大量的新生軟骨樣細(xì)胞和少許炎性細(xì)胞分布。結(jié)論:以上研究表明,ECM修飾的溫敏性瓊脂糖/明膠/HA水凝膠材料是一種有前景的可用于軟骨再生的醫(yī)用生物材料。
【圖文】：

周邊有偽足伸出，大多呈多角形、短梭形（如圖1-1A 所示）；P1 代 BMSC 細(xì)胞體積明顯增大，形狀不規(guī)則且排列比較紊亂，表面有較多透亮的圓形造血細(xì)胞（如圖 1-1B 所示）；P2 代 BMSC 細(xì)胞排列開(kāi)始有規(guī)律，圓形透亮的造血細(xì)胞數(shù)量明顯減少（如圖 1-1C）；P3 代 BMSC 細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，排列十分整齊，且大小和形態(tài)基本相同，排列方向也基本一致（如圖 1-1D）。圖 1-1：BMSC 的形態(tài)A. P0 代 BMSCs； B. P1 代 BMSCs； C. P2 代 BMSCs； D. P3 代 BMSCs；（100×）ABC D

圖 1-2：BMSCs 細(xì)胞周期鑒定（實(shí)驗(yàn)次數(shù) n=3）Fig 1-2. Identification of BMSCs cell cycle (repetition times n=3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（如圖 1-2）顯示：P3 代 BMSCs 處于 G1 期、S 期和 期的相對(duì)比例分別為(85.58 ± 0.72)%、(1.38 ± 0.29)%、(13.04 ± 0.54)%，，表明細(xì)胞基本處于 G1 期（即 DNA 合成前期），具有分裂分化潛能和干細(xì)胞特征。2.3 BMSCs 的表面標(biāo)志物鑒定流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（如圖 1-2）顯示，BMSCs 表面標(biāo)志物 CD29 和 CD的表達(dá)結(jié)果為陽(yáng)性，表達(dá)率分別為（99.5 ± 0.03）%、（99.6 ± 0.01）%，造血干胞的表面標(biāo)志物 CD45 的結(jié)果為陰性，表達(dá)率為（0.12 ± 0.01）%，說(shuō)明具有骨髓充質(zhì)干細(xì)胞的特性。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2658223