【摘要】：目的本實驗將二甲基乙二�；拾彼�(dimethyloxallyl glycine,DMOG)、I型膠原、煅燒骨(true bone ceramic,TBC)制備成負載DMOG的I型膠原(Collagen Type I,COL I)煅燒骨復(fù)合支架材料。研究復(fù)合支架材料的表征,并在細胞水平和動物水平評價復(fù)合支架材料的成骨活性和骨修復(fù)能力。方法1、分離SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)并在體外培養(yǎng)。2、通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色檢測DMOG對BMSC成骨分化的影響。3、分別制備單純TBC支架、COL I/TBC支架、DMOG/COL I/TBC支架,并對其表征進行分析,包括X射線光電子能譜(X-ray diffraction,XRD)、掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)及DMOG在復(fù)合材料中的釋放曲線。4、各組支架材料經(jīng)~(60)Co輻照滅菌后與骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)評估其相容性。5、通過RT-PCR檢測各組支架材料對BMSC成骨分化及促血管新生的能力。6、隨機選取30只新西蘭大白兔,建立股骨髁骨缺損模型,分為四組,分別為:空白對照組;單純TBC支架組;COL I/TBC支架組;DMOG/COL I/TBC支架組。于術(shù)后12W取材,行骨組織病理分析、骨形態(tài)計量測定及免疫組化評估新骨生成情況及分子機制。結(jié)果1、原代BMSC細胞培養(yǎng)72h后成多角梭形,均勻分布,第8d形成集落并達85%融合。2、ALP染色結(jié)果顯示:試驗組ALP染色比對照組顏色深,且200μM DMOG實驗組比50μM DMOG實驗組ALP染色顏色更深,三組顏色差異明顯,DMOG能顯著地提高BMSC細胞的成骨分化能力。3、XRD圖譜顯示:TBC支架材料主要成分為羥基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2),DMOG/COL I/TBC支架中含有DMOG分子。4、SEM掃描發(fā)現(xiàn)BMSC細胞在TBC、COL I/TBC、DMOG/COL I/TBC支架材料表面均生長良好,BMSC細胞呈長梭形,BMSC細胞數(shù)量較多,連接成片且各組間無明顯差異,BMSC細胞與DMOG/COL I/TBC支架材料生物相容性較好。5、DMOG/COL I/TBC支架材料與BMSC細胞共培養(yǎng)后ALP、OCN、VEGF、Runx2的mRNA表達量明顯高于COL I/TBC支架材料組、TBC支架材料組。負載DMOG后的COL I/TBC復(fù)合支架材料對BMSC成骨分化及促血管新生的能力顯著提高。6、釋放曲線提示:DMOG在復(fù)合支架材料中沒有出現(xiàn)爆釋,在7天后仍有一定含量的DMOG釋放,且呈繼續(xù)緩慢釋放趨勢。7、骨組織病理分析、骨形態(tài)計量測定提示:空白組中幾乎無新生骨,TBC、COLI/TBC組均有少量新骨且新生骨主要集中在支架邊緣,兩組差異不明顯,而DMOG/COL I/TBC組新骨明顯多于其它組且支架中心的新生骨較多。高倍鏡下可見DMOG/COL I/TBC組新生較多毛細血管,而COL I/TBC組中較少。8、免疫組化染色提示:COL I/TBC組Runx2和CD31少量表達,而DMOG/COL I/TBC組中Runx2和CD31表達較多。結(jié)論本實驗表明DMOG能有效促進BMSC細胞成骨分化,實驗制備的復(fù)合DMOG/COL I/TBC支架材料與BMSC細胞有很好的相容性,DMOG負載至COL I/TBC支架材料能實現(xiàn)緩慢釋放,DMOG/COL I/TBC支架材料能有效促進兔股骨髁骨缺損的修復(fù)。
【圖文】：

圖 2 各組煅燒骨支架的 XRD 分析的結(jié)果注： XRD 分析結(jié)果顯示在 11°左右搭載 DMOG 的膠原涂層煅燒骨有一特征（三）DMOG/ColI/TBC 復(fù)合支架材料釋放 DMOG 的特征1、煅燒骨與 50mg/ml COL I 醋酸和 4M DMOG 溶液浸泡 48h 后24h、48h、72h、96 h 、120 h 、144 h 、168h 后檢測釋放液中 DMO在實驗的第一天累計釋放約為 60%的 DMOG，主要是釋放物理吸附部后是一個較長時間的緩慢釋放，在我們觀察的 7 天內(nèi)，均可見 DDMOG/ColI/TBC 復(fù)合支架中緩慢釋放。

圖 3 DMOG/COLI/TBC 支架材料中 DMOG 的緩釋曲線二、DMOG/COL I/TBC 支架材料對 BMSC 成骨分化的影響（一）SD 原代 BMSC 細胞的分離與培養(yǎng)按實驗中方法分離 6 月齡 SD 大鼠的 BMSC 細胞�？梢娫� BMSC 細養(yǎng) 72h 后成多角梭形、但分布不均。第 3 代 SD 大鼠的 BMSC 細胞形態(tài)較呈纖維樣。培養(yǎng)至第 5 代時，，BMSC 細胞形態(tài)和狀態(tài)均不佳。故本研究選代 BMSCs 用于細胞的黏附和成骨分化實驗。P0 P3 P5
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

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本文編號：2650613