【摘要】：目的:(1)研究采用高分辨顯微斷層掃描(Micro-CT)掃描獲取新西蘭大白兔坐骨神經三維結構的最佳實驗條件。(2)以兔坐骨神經為“原型”,設計可引導神經組織內部各神經束準確支配遠端靶神經纖維的多通道神經導管數(shù)字化模型。以PLGA及明膠為原材料制備仿生多通道神經導管,評價多通道導管物理及生物性能。(3)將制備的仿生多通道神經導管植入新西蘭大白兔坐骨神經缺損處,探討定制化的仿生多通道組織工程神經導管對新西蘭大白兔坐骨神經缺損修復的作用機制。方法:(1)取成年新西蘭大白兔中段坐骨神經組織標本10mm,A、B組分別用20%、40%Lugol's液對神經標本染色,光學顯微鏡及Micro-CT下分別采集兩組標本在1-3天染色過程中,每1天時間點的顯像變化。將顯像良好的Micro-CT圖像序列導入三維重建軟件(Mimics)軟件,通過三維重建圖形實現(xiàn)兔坐骨神經顯微三維結構的可視化。(2)取6只成年新西蘭大白兔中段坐骨神經25mm標本,采用Micro-CT掃描及HE色切片染法獲得神經各束解剖學數(shù)據(jù),對上述兩種圖像從神經束的數(shù)量、面積、是否存在神經束之間融合或分離現(xiàn)象等方面進行對比觀察。依據(jù)神經組織HE染色切片及Micro-CT圖像,采用Adobe Photoshop軟件設計4組具有多組通道結構神經導管數(shù)字模型。采用靜電紡絲、冷凍干燥、3D打印等技術構建4種通道類型的PLGA/明膠微孔神經導管。通過觀察其外貌特征,吸水膨脹實驗、熱收縮及力學性能測量等實驗進行導管物理屬性評價,細胞增殖實驗及酶降解實驗被用于評價導管生物學屬性。(3)將仿生多通道神經導管植入新西蘭大白兔中段坐骨神經10mm缺損模型。以自體神經移植及單通道(1-CANC)神經導管作為對照組,通過組織學切片觀察、肌電生理檢測、逆向熒光示蹤等實驗探討仿生神經導管定制化的多通道結構對周圍神經軸突再生的作用。結果:(1)A組神經標本在染色3天、B組標本在染色2天可經Micro-CT掃描獲得較為清晰的神經顯微三維結構的圖像。Micro-CT圖像顯示新西蘭大白兔坐骨神經中各神經束立體行徑相對固定,生成的數(shù)字化三維模型可在任意橫斷面實現(xiàn)坐骨神經內部顯微結構可視化觀察。(2)新西蘭大白兔坐骨神經中段具有11±1個呈不規(guī)則排列的神經束,Micro-CT掃描提示坐骨神經中段25mm各神經束之間無明顯的融合或分離現(xiàn)象。采用Adobe Photoshop軟件測量CANC導管通道和神經束匹配指數(shù)(MI)得出:3-CANC組最高(84.4%),4-CANC組最低(51.4%),2-CANC和3-CANC組MI分別為75.5%、77.1%。實驗結果表明:制備的CANC導管具有一致的外貌、孔隙率、熱收縮性能特征;吸水膨脹方面:1-CANC導管組與2-,3-,4-CANC組相比,其吸水后管腔橫截面積更易于減小(p0.05);側方應力實驗中1-通道導管抗壓強度最高,4-CANC較2-CANC組可承受更高的側方壓力(p0.05);抗彎曲實驗顯示:4-CANC抗彎強度高于3-CANC和2-CANC(p0.05);體外降解實驗顯示:與PLGA生物膜相比1-、4-CANC神經導管具有較快的降解速率;細胞增殖實驗顯示:附著于PLGA/明膠導管組Schwann細胞數(shù)量多余于PLGA生物膜組(p0.05),CANC導管組組間Schwann細胞數(shù)量無差異(p0.05)。(3)在植入兔坐骨神經缺損模型術后第12、24周觀察發(fā)現(xiàn),自體神經移植組在組織學觀察、電生理檢測及(感覺、運動)功能恢復方面效果優(yōu)于所有神經導管植入組(p0.01)。有髓神經纖維計數(shù)結果顯示:各CANC神經導管組之間有髓神經纖維數(shù)量無差異。但(2-CANC、3-CANC組)相對(1-CANC和4-CANC組),在電鏡下觀察到了直徑更大且髓鞘更厚的成熟神經軸突組織。類似的對比結果也出現(xiàn)在肌電生理檢測、自噬行為及運動功能評定實驗。逆行熒光示蹤實驗結果顯示,CANC導管組中各組被熒光標記的神經元計數(shù)無統(tǒng)計學差異(p0.05),而其中被FB-NY雙標記神經元比例最高的是1-CANC組(7.1%±2.4%),4-CANC組最低(2.2%±1.2%),結果具有顯著差異(p0.05)。結論:(1)采用20%Lugol's液染色3天或40%Lugol's液染色2天后的神經標本經Micro-CT掃描可獲得較為清晰的顯微三維圖像。生成的三維重建模型可作為設計三維仿生人工神經導管重要參考依據(jù)。(2)Micro-CT掃描可準確、清晰的連續(xù)觀察新西蘭大白兔坐骨神經中段顯微三維結構,聯(lián)合3D打印模具、冷凍干燥及靜電紡絲等技術可制備出簡易的以兔坐骨神經解剖結構為“原型”的仿生多通道神經導管。上述方法制備的多通道仿生PLGA/明膠神經導管具有較好的生物屬性和物理機械性能,可滿足人工神經導管植入于動物前期實驗研究要求。(3)仿生數(shù)字化人工神經的多通道結構參數(shù)對神經組織修復再生過程具有顯著影響。高度仿生的神經導管多通道結構具有降低神經軸突發(fā)生錯配的作用。導管通道與神經束匹配指數(shù)(MI)可能可作為研究定制化多通道神經導管仿生程度的一項評價指標。定制化的仿生神經導管多通道結構(管腔直徑大小、管腔分布位置等)與修復靶神經中相應神經束解剖結構越相似,多通道神經導管MI指數(shù)越高其修復效果可能越好。
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R318.1;R688

【參考文獻】

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本文編號：2646359