【摘要】：研究意義及背景:自體肋軟骨由于其組織量大,取材相對(duì)方便,在臨床上常用作一種理想的修復(fù)、填充、支持材料。既往軟骨移植方式常為采用大塊的軟骨組織或拼接后的軟骨支架來進(jìn)行器官的再造或修復(fù)以及受區(qū)欠缺的填充,這種方式存在著軟骨用量多且靈活性差、浪費(fèi)嚴(yán)重、修復(fù)效果不足、雕刻復(fù)雜、細(xì)節(jié)刻畫不足等缺點(diǎn)。有人提出將軟骨移植過程中所用的軟骨團(tuán)塊的體積減小,以達(dá)到精細(xì)塑形的目的。關(guān)節(jié)外科領(lǐng)域有學(xué)者發(fā)現(xiàn)這種移植方式不僅可以增加其應(yīng)用靈活性,而且可以提升軟骨細(xì)胞增殖遷移活性,可部分達(dá)到類似于組織工程修復(fù)的效果,還可規(guī)避組織工程的缺點(diǎn)。我們設(shè)計(jì)了軟骨微組織體外培養(yǎng)、構(gòu)建肋軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體并體外培養(yǎng),肋軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體塑形后即刻體內(nèi)培養(yǎng)三部分實(shí)驗(yàn)予以探究。以明確肋軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體再生的具體過程及其機(jī)制,觀察軟骨微組織及上述復(fù)合體的生物學(xué)轉(zhuǎn)歸,以尋找一種可以提升移植軟骨增殖活性,減少肋軟骨采取量,提高自體肋軟骨應(yīng)用效率的方法,并提供實(shí)(試)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究目的:1.研究肋軟骨微組織化后微組織體外培養(yǎng)細(xì)胞遷移及增殖情況,并探究軟骨微組織的徑長對(duì)軟骨細(xì)胞遷移及增殖影響。2.構(gòu)建軟骨仿生基質(zhì),并形成軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體,在體外培養(yǎng)的過程中模擬軟骨微組織體內(nèi)移植后的局部環(huán)境,探究在這種條件下軟骨微組織內(nèi)軟骨細(xì)胞的外遷及增殖活性。3.探究體內(nèi)環(huán)境對(duì)軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體內(nèi)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,探究復(fù)合體體內(nèi)移植后的生物學(xué)轉(zhuǎn)歸。研究方法:1.采取小型豬肋軟骨,用薄刃三孔刀片切割粉碎成軟骨微組織,過實(shí)驗(yàn)細(xì)胞篩,獲得徑長分別為200um,200um～400um,400um～800um三組軟骨微組織。體外培養(yǎng)14天,在第3天、7天、14天大體及顯微鏡下觀察并比較各組軟骨微組織內(nèi)細(xì)胞遷出及增殖情況。2.提取Ⅱ型膠原蛋白(COL-Ⅱ),并復(fù)合透明質(zhì)酸(HA)及硫酸軟骨素(CS),形成COLⅡ/HA/CS濃度為8/0.5/1.5mg/ml的仿生基質(zhì)溶液,添加10×DMEM培養(yǎng)基形成含有DMEM培養(yǎng)基的仿生基質(zhì)。將軟骨微組織按與仿生基質(zhì)溶液體積比1:1的比例混勻,孵育形成固體后體外培養(yǎng)14天,進(jìn)行HE染色觀察。3.采取小型豬肋軟骨,形成軟骨微組織,復(fù)合仿生基質(zhì)形成固態(tài)軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體,在豬自體肋軟骨采取術(shù)后4小時(shí)以內(nèi)將上述復(fù)合體埋置入實(shí)驗(yàn)豬皮下。2月,4月后分兩批取出所植入復(fù)合體,大體觀察其生物學(xué)特性并做HE染色,觀察其生物學(xué)轉(zhuǎn)歸。研究結(jié)果:1.肋軟骨微組織化及軟骨微組織徑長對(duì)軟骨細(xì)胞遷移及增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究(1)薄刃刀片切割細(xì)胞篩過濾法形成的肋軟骨微組織活性良好,部分軟骨陷窩呈切開狀態(tài),陷窩內(nèi)軟骨細(xì)胞情況良好。(2)培養(yǎng)第 3 天、7 天、14 天,徑長200um,200um～400um,400um～800um三組軟骨微組織成活良好,軟骨陷窩內(nèi)軟骨細(xì)胞成活良好。(3)培養(yǎng)第3天、7天、14天分別在40倍、100倍、200倍鏡下觀察徑長200um,200um～400um,400um～800um三組軟骨微組織,均未見細(xì)胞明顯遷出及增殖。2.仿生基質(zhì)的制備及其對(duì)軟骨微組織軟骨細(xì)胞遷移及增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究(1)獲得的固態(tài)仿生基質(zhì)生物學(xué)特性良好,單純仿生基質(zhì)呈白色,加入DMEM培養(yǎng)基后形成的軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體呈淡粉色。仿生基質(zhì)(復(fù)合體)具有類似鼻尖的硬度,彈性。(2)培養(yǎng)期觀察軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體可見培養(yǎng)基清亮,肉眼觀察復(fù)合體形態(tài)良好,形狀及特性未見明顯改變。排水法測量培養(yǎng)后軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體體積與培養(yǎng)前無明顯差別。(3)鏡下觀察培養(yǎng)14天后的軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體HE切片示軟骨微組織及軟骨細(xì)胞在仿生基質(zhì)中成活良好,軟骨微組織外未見明顯軟骨細(xì)胞遷出,未見明顯軟骨細(xì)胞增殖。3.軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體自體即刻回植體內(nèi)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究(1)體內(nèi)移植2月、4月后獲取軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體,大體觀察上述復(fù)合體形狀不規(guī)則,在體內(nèi)存在部分降解,隨時(shí)間延長,其降解率提高。(2)大體觀察移植后2月的軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體剖面可見局部存在不規(guī)則的軟骨團(tuán)塊,質(zhì)地及硬度較正常軟骨稍差,各團(tuán)塊之間存在厚薄不均的纖維結(jié)締組織。移植4月后復(fù)合體質(zhì)地、硬度與正常軟骨類似,其余同移植2月的復(fù)合體類似。(3)體內(nèi)培養(yǎng)2月后的軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體HE切片示軟骨微組織及軟骨細(xì)胞存活良好,軟骨仿生基質(zhì)部分降解,未見明顯的軟骨細(xì)胞在軟骨微組織外增殖。(4)體內(nèi)培養(yǎng)4月后的軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體HE切片示軟骨微組織及軟骨細(xì)胞存活良好,軟骨微組織間隙內(nèi)存在大量纖維組織,間隙較內(nèi)培養(yǎng)2月時(shí)明顯縮短,仿生基質(zhì)幾乎不可見。100倍鏡下觀察,局部可見兩種形式軟骨微組織外增殖:1.以軟骨微組織為中心的細(xì)胞簇樣增殖,尚未見有大量的軟骨基質(zhì)分泌;2.軟骨細(xì)胞散在增殖,伴基質(zhì)分泌。研究結(jié)論:1.肋軟骨微組織化及軟骨微組織徑長對(duì)軟骨細(xì)胞遷移及增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究(1)薄刃刀片切割細(xì)胞篩過濾法可切開軟骨陷窩并形成活性良好的肋軟骨微組織。(2)軟骨微組織體外培養(yǎng)過程中微組織及其內(nèi)的軟骨細(xì)胞存活。(3)軟骨微組織內(nèi)的軟骨細(xì)胞于培養(yǎng)14天內(nèi)未見明顯外遷及增殖。(4)軟骨微組織的徑長于組織內(nèi)軟骨細(xì)胞的遷移、增殖活性無明確關(guān)系。2.仿生基質(zhì)的制備及其對(duì)軟骨微組織軟骨細(xì)胞遷移及增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究(1)COL-Ⅱ/CS/HA所形成的肋軟骨仿生基質(zhì)生物相容性良好,組織及細(xì)胞在其內(nèi)存活良好。(2)軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體體外培養(yǎng)14天體積無明顯變化。(3)體外培養(yǎng)環(huán)境下,復(fù)合體內(nèi)軟骨細(xì)胞未見明確遷移與增殖;該仿生基質(zhì)在體外培養(yǎng)環(huán)境下不能誘導(dǎo)軟骨微組織內(nèi)軟骨細(xì)胞的遷移與增殖。3.軟骨微組織=仿生基質(zhì)復(fù)合體自體即刻回植體內(nèi)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究(1)軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體在體內(nèi)有良好的生物相容性,仿生基質(zhì)可被降解。(2)軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體內(nèi)軟骨組織成活良好,在體培養(yǎng)環(huán)境下纖維組織包裹成一整體。(3)皮膚下移植軟骨微組織-仿生基質(zhì)復(fù)合體的方式可以出現(xiàn)兩種形式的細(xì)胞增殖:1.不伴基質(zhì)分泌的以軟骨微組織為中心的細(xì)胞簇樣增殖;2.伴基質(zhì)分泌的軟骨細(xì)胞散在增殖。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2643615