【摘要】：第一部分激光微孔豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(LPADM)構(gòu)建這個部分采用紫外激光貫穿形成3D矩陣的材料結(jié)合化學(xué)高滲鹽脫細(xì)胞、戊二醛交聯(lián)等制作過程制成了激光微孔豬脫細(xì)胞真皮(LPADM),并采用病菌學(xué)、大體、組織學(xué)及掃描電鏡觀察、高光譜圖像智能識別分析LPADM基本特征。目的:構(gòu)建激光微孔豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(LPADM)。方法:體質(zhì)量25Kg左右健康小白豬1只,肥皂水洗刷,處死,去毛后剝?nèi)”巢咳珜悠つw,去脂后,體積分?jǐn)?shù)0.1%苯扎溴胺浸泡15min,生理鹽水沖洗干凈,手持電動取皮刀首先切取0.2mm厚度的刃厚皮片,去除表皮及基底膜層,然后在創(chuàng)面真皮組織上再切取約0.3mm厚度真皮斷層皮片,分成兩部分進(jìn)行如下處理。(1)一部分豬真皮采用獨(dú)特激光模板懸空打孔技術(shù)處理。將含有乳突層、部分網(wǎng)狀層真皮片懸空固定在紫外激光加工設(shè)備平臺上,保持皮片上下表面平整且濕潤,調(diào)節(jié)設(shè)備參數(shù)為出射功率密度最小1OOOOW/mm2,微孔孔徑135um,兩孔間間隙lmm,經(jīng)由相應(yīng)孔徑和孔間隙激光模板引導(dǎo),在1.Ocm*1.Ocm規(guī)格區(qū)域快速擊穿樣品,形成100個微孔區(qū),然后在2%NaCL、0.5%戊二醛脫去微孔化豬真皮細(xì)胞并交聯(lián),獲得激光微孔豬真皮基質(zhì)(LPADM)。獲得的LPADM,60Co照射滅菌后制成5.0cm×5.0cm大小規(guī)格4 ℃冷藏保存。(2)另一部分豬真皮不打孔,同上脫細(xì)胞及交聯(lián)制成同樣規(guī)格無孔豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM),按同樣技術(shù)手段脫細(xì)胞及交聯(lián)處理,4 ℃冷藏保存。對所制備的LPADM進(jìn)行大體、組織學(xué)及掃描電鏡觀察、高光譜指紋分析。結(jié)果:LPADM、無孔PADM均柔軟、有彈性,瓷白色,組織學(xué)觀察顯示真皮基質(zhì)內(nèi)未見完整細(xì)胞成分,結(jié)構(gòu)未見明顯紊亂,基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞較為徹底干凈。LPADM除了以上形態(tài)特點(diǎn),還有貫穿性圓形、均一微孔結(jié)構(gòu)。組織學(xué)檢查顯示LPADM微孔邊緣激光炭化程度輕。掃描電鏡示孔徑中膠原纖維排列有序。LPADM的激光微孔化處理后,光譜曲線在20波段,表現(xiàn)為深“V”形指紋特征,組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)很大程度的特征指紋光譜圖像明顯差異,提示材料本身性狀存在處理前后不同。結(jié)論:LPADM是一種擁有著創(chuàng)新的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)特性的新型脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。第二部分LPADM的體外實驗本實驗包含兩部分內(nèi)容。第一部分實驗:采用LPADM-Fb共培養(yǎng)及早期的培養(yǎng)液中的多種活性細(xì)胞因子檢測,驗證LPADM低/無毒性,良好的細(xì)胞相容性;同時論證體外預(yù)先將LPADM轉(zhuǎn)變?yōu)楹谐衫w維細(xì)胞的LPADM作為“活性復(fù)合材料”的必要性和合理性。第二部分實驗:采用間充質(zhì)來源的兩種干細(xì)胞BMSCs、ADSCs分別與LPADM體外共培養(yǎng),驗證LPADM的多種細(xì)胞相容性和作為體外干細(xì)胞培養(yǎng)平臺的可行性,為下一步在體試驗奠定基礎(chǔ)。目的:LPADM分別與FB、BMSC、ADSCs體外共培養(yǎng),驗證LPADM對以上三種細(xì)胞分別在細(xì)胞毒性、細(xì)胞相容性和細(xì)胞生物學(xué)活性方面的影響。方法:分別將FB、BMSC、ADSCs與LPADM體外六孔培養(yǎng)板共培養(yǎng),具體分為以下五步:(1)取保存?zhèn)溆玫腖PADM與無孔PADM,制備成2.0cm×2.0cm×0.3 mm大小,分別置于6孔培養(yǎng)皿中,用DMEM培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)10%FBS制備的Fb培養(yǎng)液培養(yǎng);取1只SD大鼠分離培養(yǎng)其自體皮片中的Fb,取第3代Fb部分以1 × 105個/mL密度接種于2種ADM表面,分別為LPADM-FB組與無孔PADM-FB組。(2)40倍倒置相差顯微鏡下觀察各組Fb生長情況。接種第1、3、5天,采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定各組Fb細(xì)胞活性因子TGF-β 1、LN、VEGF、IL-6、、IL-10在492 nm波長處的吸光度值,每組每時相點(diǎn)6個樣本,按相應(yīng)試劑盒具體操作說明書進(jìn)行。(3)取第3代BMSCs貼壁細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至I× 104個/mL,按每孔1 mL細(xì)胞懸液分別接種于2塊6孔培養(yǎng)板,分別設(shè)3個孔為成骨組和成脂組,另分設(shè)3個孔均為陰性對照組,然后行分化鑒定。成骨組茜素紅染色、成脂油紅0染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察。(4)超凈臺環(huán)境中將LPADM剪成2 cm×2 cm大小放于6孔板中,微孔化真皮基質(zhì)表皮面朝上。取生長良好的第三代BMSCs,胰蛋白酶消化,密度調(diào)整至4×105個/mL的細(xì)胞懸液,接種lmL的細(xì)胞懸液在六孔板LPADM的表面,放入37 ℃、5%C02飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h,進(jìn)行第一次換液,再置于37 ℃、5%C02飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),每2d換液一次,體外共培養(yǎng)5 d。同期,重復(fù)以上操作接種一批無孔化真皮基質(zhì)(PADM)。構(gòu)建成BMSCs-LPADM和BMSCs-PADM兩種含有BMSCs的微孔化和無孔化的真皮基質(zhì)待移植材料。(5)同上,利用購買的脂肪源干細(xì)胞(ADSCs)細(xì)胞株,體外傳代第三代,與ADSCs-LPADM體外共培養(yǎng),觀察ADSCs增殖、生長、遷移情況。結(jié)果:(1)成纖維細(xì)胞與LPADM共培養(yǎng),傳至第3代時,形態(tài)趨于一致,呈Fb樣,生長較快;(2)接種第1、3、5天,采用雙抗體夾心ABC-ELISA法在492nm波長處,測定各組Fb細(xì)胞活性因子TGF-β 1、LN、VEGF、IL-6、IL-10的吸光度值存在統(tǒng)計學(xué)意義(F為0.050～1.763,P0.05);(3)BM-MSCs細(xì)胞形態(tài),成脂、成骨分化鑒定和BM-MSCs-BMSC-LPADM共生長特點(diǎn)。分離得到的單核細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下呈圓形,折光性強(qiáng)。培養(yǎng)2d后可見部分細(xì)胞貼壁生長,呈梭狀。培養(yǎng)5 d時,細(xì)胞已出現(xiàn)分裂增殖。培養(yǎng)12 d時細(xì)胞融合達(dá)80%,此時細(xì)胞呈現(xiàn)為Fb樣。至第3代時,細(xì)胞形態(tài)趨于一致,為Fb樣,細(xì)胞生長較快,每7天傳代1次。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)3d,細(xì)胞密度增大,呈短梭形。培養(yǎng)5 d,細(xì)胞形態(tài)不一,部分細(xì)胞呈現(xiàn)為多角形。培養(yǎng)7 d,細(xì)胞間可見細(xì)小的鈣質(zhì)沉積。培養(yǎng)10 d,形成明顯的鈣結(jié)節(jié);陰性對照組細(xì)胞密度增加,未見鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn)。茜素紅染色,成骨組細(xì)胞可見散在的鈣結(jié)節(jié),高倍鏡下呈深紅色,陰性對照組無明顯改變。成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)3d,細(xì)胞中可見細(xì)小脂滴,部分細(xì)胞質(zhì)反光增強(qiáng),5 d后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)小脂滴并逐漸融合,10 d后出現(xiàn)明顯的脂滴,且含有脂滴的細(xì)胞變?yōu)閳A形或多邊形;陰性對照組細(xì)胞無顯著變化。油紅O染色,成脂組見大量含有紅色脂滴的成脂肪細(xì)胞,陰性對照組未見明顯改變。(4)脂肪源干細(xì)胞(ADSCs)-LPADM觀察ADSCs細(xì)胞增殖活力強(qiáng)、生長以及細(xì)胞爬片。1-2天爬滿12孔板基底。結(jié)論:經(jīng)過脫細(xì)胞和激光連續(xù)微孔(氣化)蛋白質(zhì)源性材料的豬真皮組織后,體外與分別與成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、ADSCs體外共培養(yǎng),三種細(xì)胞的生物學(xué)活性表現(xiàn)正常,LPADM未見明顯細(xì)胞毒性作用;LPADM作為真皮替代物具有良好的細(xì)胞相容性,可為終末分化細(xì)胞--成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)來源的兩種干細(xì)胞(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源性干細(xì)胞)體外細(xì)胞培養(yǎng)提供3D生物源性平臺。第三部分在體LPADM移植實驗本實驗包括以下五個部分。第一步采用皮下埋藏實驗論證組織相容性及血管化初形成能力評測;第二步采用游離的自體皮片在體移植試驗,檢驗LPADM形成早期血管化程度;第三步連續(xù)動態(tài)采集術(shù)區(qū)HE組織學(xué)圖像,高光譜分析分析LPADM光譜特征,指紋光學(xué)特性,檢評其作為移植過程血管化進(jìn)程的可行性及特點(diǎn);第四步LPADM-BMsc在體移植,外源性的BMsc在體觀察到新生分化為皮膚附件器官的現(xiàn)象,提示了 LPADM作為BMsc的載體及持續(xù)促進(jìn)BMsc分化定向可能具有潛在作用。第五步采用另一種人源脂肪內(nèi)源性干細(xì)胞在體驗證LPADM的作為多種干細(xì)胞在體移植的“載體”的穩(wěn)定性和普遍適用性。目的:1、在體驗證LPADM的細(xì)胞、生物相容性和血管化能力和評測;2、LPADM復(fù)合含有骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞(BMsc)的大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞群的對裸鼠部分皮膚附件細(xì)胞再生修復(fù)的作用;3、驗證LPADM可以為間充質(zhì)干細(xì)胞提供較理想的3D生物平臺。方法:(1)皮下埋藏試驗。驗取21只大鼠,硫化鈉去毛24 h后,30 g/L戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉,對稱“U”型切開脊柱兩側(cè)背部全層皮膚至深筋膜,造成2.0 cm×2.0 cm大小創(chuàng)面,將LPADM與無孔豬ADM剪裁成相應(yīng)大小分別移植于左右兩側(cè)筋膜層上,打包固定,單籠飼養(yǎng)。分別于術(shù)后1、3、10 d觀察大鼠的體質(zhì)量變化、死亡率及皮膚有無過敏、感染征象等,同時切取深筋膜下含有LPADM與無孔豬ADM標(biāo)本行組織學(xué)檢查。(2)自體皮片移植試驗。分為自體刃厚、自體中厚皮片逐步驗證其血管化臨床能力。在大鼠背部造成一個2.0 cm×2.0 cm大小的“口”型創(chuàng)面,深筋膜表面放置LPADM,將創(chuàng)區(qū)全厚皮片修薄成中厚皮片同步移植于其上,縫合、打包固定,單籠飼養(yǎng)。分別于術(shù)后相應(yīng)觀測點(diǎn)按隨機(jī)數(shù)字表法取大鼠,觀察其體質(zhì)量變化、死亡率及皮膚有無過敏、感染征象等,同時切取LPADM標(biāo)本行組織學(xué)檢查。移植皮成活標(biāo)準(zhǔn)為早期皮片色澤紅潤、平坦,與受皮區(qū)基底貼附緊密。(3)將(2)中1-15天內(nèi)的不同時間段LPADM標(biāo)本取材,制作成HE組織切片,同步進(jìn)行高光譜成像觀測和分析。(4)BMsc-LPADM在體移植修復(fù)和皮膚附件新生試驗。將1只SD大鼠處死.取股骨和脛骨,分離培養(yǎng)骨來源的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞群,取第3代貼壁細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂肪細(xì)胞分化實驗。之后將其接種于LPADM、無孔PADM上,構(gòu)建骨髓間充質(zhì)細(xì)胞.LPADM和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞-無孔PADM。取21只健康裸鼠隨機(jī)區(qū)組分為骨髓間充質(zhì)細(xì)胞-LPADM+無孔豬ADM組(簡稱A組,6只)、LPADM+刃厚皮片組(簡稱B組,6只)、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞-LPADM+刃厚皮片組(簡稱c組,6只)、骨髓間允質(zhì)細(xì)胞-無孔豬ADM+刃厚皮片組(簡稱D組,3只),麻醉后在其背部正中做一 2cm×2cn,的全層皮膚缺損創(chuàng)面,達(dá)深筋膜,同時切取相同大小刃厚皮片備用,并分別移植相應(yīng)材料覆蓋創(chuàng)面于移植術(shù)后5、7、14 d觀察裸鼠術(shù)區(qū)愈合情況及不良反應(yīng),各組分別處死1只裸鼠切取全部移植物,HE染色觀察其組織結(jié)構(gòu);移植術(shù)后7、14 d透射電鏡下觀察相應(yīng)復(fù)合物中新生皮膚附件情況。(5)LPADM+脂肪源干細(xì)胞(ADSCs)小動物活體成像試驗。體外構(gòu)建LPADM+ADSCs,在體移植鼠背部,左側(cè)為實驗組:LPADM+ADSCs,右側(cè)為對照組:LPADM。術(shù)后第7、10、14d采用小動物活體成像技術(shù)觀察外源性ADSCs在體活動情況:增殖合遷移。結(jié)果:(1)LPADM皮下埋藏實驗。組織學(xué)檢查:LPADM移植于SD大鼠背部創(chuàng)面后24 h,組織學(xué)檢查即可觀察到材料周圍膠原蛋白沉積,未見新生組織及新生血管;透射電鏡下觀察到新生的單一結(jié)構(gòu)的類血管內(nèi)皮細(xì)胞。術(shù)后3d，，LPADM基質(zhì)泛紅明顯,提拉時其與筋膜及周圍組織黏附尚緊密;LPADM的HE染色可見激光打孔處新生組織生長,其中新生血管廣泛存在于微孔周圍和微孔內(nèi),常以含有多枚重疊紅細(xì)胞征象,微孔內(nèi)外炎性細(xì)胞少見。術(shù)后10 d,LPADM中血管化已呈網(wǎng)絡(luò)狀。透射電鏡未見無孔ADM新生的類血管內(nèi)皮細(xì)胞。術(shù)后無孔ADM組組織學(xué)觀察創(chuàng)面中可見炎性細(xì)胞,但未見有血管形成。(2)LPADM聯(lián)合刃厚皮片移植實驗。1、移植術(shù)區(qū)局部觀察兩組動物均存活,但不同時間移植皮片的顏色外觀有差別。24h的LPADM組和PADM組移植皮片均蒼白,無血色明顯差異,大體差異不明顯;72h的LPADM組移植皮片呈現(xiàn)白粉基本色,其下LPADM材料明顯泛紅,與筋膜及周圍組織黏附緊密,PADM組皮片蒼白,其下PADM呈瓷白色,與筋膜及周圍組織黏附一般,可輕拉下自然分離,滲出明顯,多伴有異味;5天的LPADM組皮片呈現(xiàn)基本粉紅色,PADM組皮片不同程度發(fā)黑,部分甚至出現(xiàn)干癟或潮濕,異味加重,差別明顯;10天LPADM組皮片呈現(xiàn)明顯粉紅色,術(shù)后14天,實驗組創(chuàng)面移植復(fù)合皮片生長情況好,真皮基質(zhì)和皮片融合,平整,縫合處未見疤痕形成。對照組皮片壞死干燥,顯著差別。2、創(chuàng)面愈合率術(shù)后2周,復(fù)合皮片實驗組完全存活,而對照組皮片大部分壞死脫落,兩組創(chuàng)面愈合率相比,99.40%±0.24%:25.41%±1.32%。(p0.05,差異具有顯著性)。3、HE組織檢查結(jié)果術(shù)后24h,LPADM孔內(nèi)可見白細(xì)胞浸潤和滲出的纖維素,未見新生血管;術(shù)后72h,微孔內(nèi)可見到新生血管,內(nèi)含多個紅細(xì)胞,炎性細(xì)胞少見;術(shù)后5天,LPADM處表現(xiàn)良好炎癥反應(yīng),大量幼稚毛細(xì)血管從創(chuàng)面基底面向上涌向微孔處;術(shù)后10d,LPADM周圍血管呈網(wǎng)絡(luò)狀,炎癥細(xì)胞輕度分散。14天,LPADM周圍血管化豐富,炎癥反應(yīng)輕微。無孔PADM,術(shù)后HE觀察可見創(chuàng)面中大量炎性細(xì)胞,未見血管形成。4、兩組ADM膠原網(wǎng)架中所成纖維細(xì)胞遷入及比較術(shù)后1、3天實驗組創(chuàng)面基底新生組織涌向微孔結(jié)構(gòu),并從微孔底部向微孔內(nèi)生長,取材過程中發(fā)現(xiàn)LPADM與創(chuàng)基的聯(lián)合緊密,對照組較為松散,輕拉易與基底分離。術(shù)后3天,實驗組顯示微孔結(jié)構(gòu)中有自基底向孔內(nèi)涌入生長的大量新生組織,孔周邊的基質(zhì)中有較多的成纖維細(xì)胞形成的大量新膠原遷入。對照組的未打孔的基質(zhì)膠原網(wǎng)偶見成纖維細(xì)胞散在的遷入現(xiàn)象。5、電鏡觀察結(jié)果術(shù)后3天的掃描電鏡顯示,實驗組基底的基質(zhì)組織和新生肉芽組織通過孔徑結(jié)構(gòu)沿著孔徑內(nèi)部從基底垂直向上涌向LPADM膠原網(wǎng)架中形成新基質(zhì)生長,新生組織內(nèi)小血管的生長旺盛',為基質(zhì)膠原網(wǎng)架中遷入的成纖維細(xì)胞的生長、增殖、分裂及分泌活動提供了良好的基質(zhì)新生微環(huán)境。術(shù)后14天的透射電鏡顯示,實驗組雖然LPADM中有及少量的炎癥細(xì)胞的遷入,遷入基質(zhì)網(wǎng)架的成纖維細(xì)胞電鏡下核大呈不規(guī)則形、分裂旺盛,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)布滿細(xì)胞液中。對照組的PADM新生組織的難以長入,遷入的成纖維細(xì)胞極少,炎癥細(xì)胞為主。(3)LPADM聯(lián)合中厚皮片移植實驗。1、大體觀察移植后14 d自體中厚皮片成活。30 d即可提捏術(shù)區(qū)皮膚,皮膚愈合質(zhì)量良好。經(jīng)復(fù)合移植的大鼠均存活,未見明顯局部和全身過敏反應(yīng),其日常行為無異常,體質(zhì)量正常增加。2、移植術(shù)區(qū)局部觀察兩組動物均存活,但移植皮片的不同時間顏色外觀有明顯差別。24h的LPADM組和PADM組皮片均蒼白,無血色,二組無大體明顯差異;72h的LPADM組皮片呈現(xiàn)基本粉紅色,其下LPADM材料明顯泛紅,與筋膜及周圍組織黏附緊密,PADM組皮片蒼白,其下PADM呈瓷白色,與筋膜及周圍組織黏附一般,可輕拉下自然分離,滲出明顯,多伴有異味;5天的LPADM組皮片呈現(xiàn)粉紅色,PADM組皮片不同程度發(fā)黑,部分甚至出現(xiàn)干癟或潮濕,異味加重,差別明顯;10天、14天的LPADM組皮片呈現(xiàn)明顯粉紅色,PADM組皮片發(fā)黑完全,干癟或潮濕,流膿,差別顯著。3、HE組織檢查結(jié)果術(shù)后24h,LPADM孔內(nèi)可見白細(xì)胞浸潤和滲出的纖維素,未見新生血管;術(shù)后72h,微孔內(nèi)可見到新生血管,內(nèi)含多個紅細(xì)胞,炎性細(xì)胞少見;術(shù)后5天,LPADM處表現(xiàn)良好炎癥反應(yīng),大量幼稚毛細(xì)血管從創(chuàng)面基底面向上涌向微孔處;術(shù)后10 d，LPADM周圍血管呈網(wǎng)絡(luò)狀,炎癥反應(yīng)良好,激光微孔孔內(nèi)壁處顏色和孔周圍ADM相融,藍(lán)色變性組織弱化。14天，LPADM周圍血管化豐富,炎癥反應(yīng)良好,激光微孔孔內(nèi)壁處顏色淡化和孔周圍ADM更相融表現(xiàn)。無孔PADM,術(shù)后HE觀察可見創(chuàng)面中大量炎性細(xì)胞,未見血管形成。(3)連續(xù)HE標(biāo)本動態(tài)高光譜分析。1、激光微孔LPADM材料高光譜分析與沒有參與動物在體實驗的LPADM全波段光譜(即0天LPADM,黑色曲線)對照,在體動物實驗的LPADM綠色曲線在橫軸20波段,均呈現(xiàn)出相應(yīng)深“V”形特征,但隨著時間1-15天,LPADM孔壁內(nèi)測局部結(jié)構(gòu)的光譜,縱軸的亮度值逐漸變大,由LPADM的1500附近(0天)到3000附近(15天),說明,隨著組織相相容性、炎癥性、孔內(nèi)壁壞死組織吸收后改善,透光度也相應(yīng)提升;2、LPADM移植后,微孔內(nèi)紅細(xì)胞高光譜分析與正常皮膚內(nèi)的成熟紅細(xì)胞全波段光譜(黑色曲線)對照,LPADM紅色曲線在特征位于10、25、40附近波段,均呈現(xiàn)出相應(yīng)“V”形特征,與成熟的紅細(xì)胞光譜曲線差異較大,但隨著時間增加,新生血管中的紅細(xì)胞光譜曲線逐漸與正常成熟紅細(xì)胞的光譜曲線相吻合,如,第3天,就10波段的亮度值已達(dá)到3600，接近正常的3800;第10天,就10波段的亮度值已達(dá)到正常的3800;說明第3天LPADM新生血管生理活力已接近正常成熟皮膚血管;3、LPADM移植后,微孔內(nèi)和微孔周圍炎癥細(xì)胞高光譜分析相同時間段,微孔內(nèi)炎癥細(xì)胞(綠色曲線)和周圍的炎癥細(xì)胞(藍(lán)色曲線)光譜相對比,兩條曲線在橫軸20波段,均呈現(xiàn)出相應(yīng)深“V”形特征,兩者差異不大,隨著時間增加,炎癥細(xì)胞光度值也未有過明顯起伏表現(xiàn),說明經(jīng)過激光貫穿、化學(xué)脫細(xì)胞處理均未對大鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)激和影響大鼠創(chuàng)面正常的修復(fù)。(4)BMsc-LPADM在體移植試驗。1、LPADM、無孔豬ADM呈瓷白色,柔軟、有彈性,組織學(xué)觀察顯示真皮基質(zhì)未見細(xì)胞成分;掃描電鏡示孔徑中膠原纖維排列有序;LPADM還有微孔結(jié)構(gòu)。2、細(xì)胞傳至第3代時,形態(tài)趨于一致,呈Fb樣,生長較快。3、誘導(dǎo)分化實驗表明,細(xì)胞可向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化。4、移植術(shù)后5 d，A組無孔豬ADM局部干燥,D組皮片局部干燥壞死,A、D組均未見感染及炎癥反應(yīng);B、C組移植皮片成活。移植術(shù)后7、14 d，A組表面的覆蓋物局部色澤發(fā)黑,干燥發(fā)硬;D組皮片出現(xiàn)完全變黑下燥壞死,皮下可見淡黃色清亮滲液;A、D組均未見明顯膿性分泌物。B、C組皮片外觀與周圍皮膚顏色接近;5、移植術(shù)后5、7 d，A、B、C組真皮基質(zhì)的微孔結(jié)構(gòu)中已見血管化,其內(nèi)可見有形紅細(xì)胞;D組移植皮片部分干燥壞死。移植術(shù)后14 d,A、B、c組真皮基質(zhì)的微孔結(jié)構(gòu)中己完全血管化,其內(nèi)可見大量的紅細(xì)胞,縱切片中,A組微孔真皮基質(zhì)成活,但與其上所覆蓋的無孔豬ADM未緊密結(jié)合;B、c組皮片與真皮基質(zhì)問連接緊密,皮片中均未見皮膚附屬器,c組創(chuàng)面皮片與真皮基質(zhì)交接處可見特殊的單層細(xì)胞;6、D組移植皮片未能成活,故放棄電鏡觀察。移植術(shù)后7 d,A、B、c組透射電鏡圖片未見明顯差別:移植術(shù)后14d，A、B組移植物中未見皮脂腺樣及汗腺樣細(xì)胞,也未見新生神經(jīng)末梢,僅見Fb遷入,c組創(chuàng)面刃厚皮與真皮基質(zhì)交接處可見大量新生毛細(xì)血管增生,Fb粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分裂增殖旺盛,可見新生的無髓神經(jīng)末梢;在真皮基質(zhì)淺層,出現(xiàn)單個游離的皮脂腺樣及汗腺樣細(xì)胞。(5)LPADM+脂肪源干細(xì)胞(ADSCs)小動物活體成像試驗。在體移植鼠背部,左側(cè)為實驗組:PADM+ADSCs,右側(cè)為對照組:LPADM+ADSCs。小鼠單籠飼養(yǎng)7、10、14d后,帶至活體成像室。3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,每只注射0.2mL。在小動物成像儀中成像(小動物活體成像儀為IVIS LuminaII),并記錄。觀察到熒光顯示,并向創(chuàng)傷區(qū)沒有干細(xì)胞鋪被區(qū)增殖和遷移。結(jié)論:LPADM是一種具有低免疫原性、早期穩(wěn)定血管化能力的一種新型真皮替代物,高光譜分析提出其特征性指紋光譜可供血管化快速鑒定,指紋特征光譜可以作為識別標(biāo)志物;LPADM有助于促進(jìn)細(xì)胞修復(fù),甚至修復(fù)皮膚附件器官新生。
【圖文】：

圖４邐（ａ）正常真皮邋（ｂ）邋ＬＰＡＤＭ、ＰＡＤＭ邋（ｃ）光譜曲線逡逑

圖３邋ａ邋ＳＥＭ邐圈３邋ｂ邋ＳＥＭ逡逑ＬＰＡＤＭｔｊ描電鏡觀察：Ｋ原纖維結(jié)構(gòu)完整、連續(xù)？末見斷裂且排列有序
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318

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本文編號：2633583