發(fā)布時間：2020-04-03 12:30

【摘要】：隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展,利用肝細胞和生物材料體外構(gòu)建類肝組織體為肝臟疾病的治療帶來了希望。但是,在目前肝組織工程的研究中,仍然存在著兩個主要問題,一個是肝細胞體外培養(yǎng)中的極性丟失問題,另一個是物質(zhì)傳遞限制導(dǎo)致的細胞壞死問題。本研究根據(jù)肝竇的結(jié)構(gòu)特征,以肝實質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞和凝膠基質(zhì)材料為基本元素,構(gòu)建一個體外類肝組織體,探索解決肝組織工程領(lǐng)域的核心問題。具體來說,我們以海藻酸凝膠作為犧牲材料,通過對其進行微加工成型、表面修飾、包埋、去凝膠化等過程操作,構(gòu)建一個基于凝膠基質(zhì)的微流控通道系統(tǒng)。在微流控通道內(nèi)種植人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs),經(jīng)過三維培養(yǎng),形成一個近似于體內(nèi)血管壁的內(nèi)皮細胞層。在此基礎(chǔ)上,將肝實質(zhì)細胞裝載到外圍凝膠基質(zhì)中,形成一個結(jié)構(gòu)有序的共培養(yǎng)體系,研究該體系對物質(zhì)傳遞和肝細胞功能的影響。具體研究內(nèi)容如下:(1)構(gòu)建一個基于海藻酸犧牲材料的微通道體系。首先通過流體紡絲法制備海藻酸微型柱狀凝膠,考察二價陽離子、針頭內(nèi)徑和流體流速對海藻酸凝膠形貌及力學(xué)性能的影響規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn),使用Ca~(2+)作為交聯(lián)因子,流體流速范圍控制在60-180μL/s的范圍,所制備的柱狀凝膠直徑與打印針頭內(nèi)徑成正相關(guān)。然后將該微型柱狀凝膠包埋在外圍基質(zhì)中,考察外圍基質(zhì)的組分對其力學(xué)穩(wěn)定性及生物性能的影響。最后,以檸檬酸鈉溶液作為液化劑,將包埋于外圍基質(zhì)體系中的海藻酸凝膠液化后形成微通道。通過考察體系中微通道的結(jié)構(gòu)及性能,篩選出一個快速有效且生物相容的去凝膠化方法。(2)微脈管系統(tǒng)的構(gòu)建。首先使用殼聚糖(CS)修飾海藻酸鈣凝膠,在其表面形成一層復(fù)合膜結(jié)構(gòu)�？疾炝藲ぞ厶桥c海藻酸鈣凝膠反應(yīng)時間對復(fù)合膜結(jié)構(gòu)及生物性能的影響。反應(yīng)時間為3-7 min時,可形成5μm-15μm厚度的殼聚糖膜。在修飾后的海藻酸鈣凝膠表面接種HUVECs,培養(yǎng)9天后,形成致密細胞層。經(jīng)細胞增殖、凋亡分析,具有復(fù)合膜的海藻酸鈣凝膠(CS/Ca-Alg)可促進細胞增殖,抑制細胞的凋亡。之后將鋪滿內(nèi)皮細胞的CS/Ca-Alg包埋于三維復(fù)合凝膠中,使用檸檬酸鈉溶液溶解并形成微脈管結(jié)構(gòu)�？疾鞕幟仕徕c溶液濃度對凝膠完全液化時間及細胞活性的影響,結(jié)果顯示15 mM的檸檬酸鈉可在20-40 min內(nèi)將直徑為500-1000μm的海藻酸鈣凝膠完全液化,且可保持細胞活性在80%以上。最后,我們分別對通道內(nèi)物質(zhì)的傳遞做了評價,發(fā)現(xiàn)具有膜結(jié)構(gòu)的微流控通道及脈管系統(tǒng)都可以選擇性的透過分子。(3)體外構(gòu)建具有脈管系統(tǒng)的類肝組織體。在上述研究工作的基礎(chǔ)上,以人肝癌細胞系(HepG2)為模型,利用該脈管系統(tǒng)組建了一個結(jié)構(gòu)有序的共培養(yǎng)體系。一方面,該脈管系統(tǒng)作為營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸系統(tǒng),為三維體系中的肝細胞代謝提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì),因此解決了僅依靠擴散效應(yīng)而形成的物質(zhì)傳遞限制問題。另一方面,該脈管系統(tǒng)作為有序共培養(yǎng)體系的架構(gòu),為肝細胞極性重建和功能修復(fù)提供了一個微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn),包埋在脈管系統(tǒng)中的肝細胞活性顯著增強,肝細胞特定功能的表達,包括白蛋白的分泌以及肝細胞特定基因的表達水平得到了顯著改善。與異物代謝相關(guān)的基因CYP1A1、CYP3A4、UGT1A1與GSTA1表達水平分別增加了3.5倍、11.1倍、7.9倍、5.6倍。與合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NDUFA3與GCLM分別增加了2.0、4.2倍。培養(yǎng)5天后,在脈管系統(tǒng)中內(nèi)皮細胞的影響下,肝細胞白蛋白的分泌量增加了2.8倍。綜上所述,本研究提出一種構(gòu)建微通道和微脈管系統(tǒng)的方法,該脈管結(jié)構(gòu)作為物質(zhì)傳遞系統(tǒng)能夠為組織體中的細胞提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。更重要的是,它可作為一個有序的共培養(yǎng)體系,為肝細胞極性重建和功能修復(fù)提供了一個良好的微環(huán)境,為探索肝組織工程的研究提供一個新思路。
【圖文】：

圖 1-1 細胞 A 與細胞 B 直接共培養(yǎng)Fig 1-1 The direct co-culture of the A cell and B cell觸共培養(yǎng)體系觸共培養(yǎng)體系，即將兩種或兩種以上的細胞分別接種于不種載體置于同一培養(yǎng)環(huán)境之中，使不同種類的細胞共用同接觸[58]。主要有條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)法、“爬片式”共培養(yǎng)法（Transwell 小室）等[59-62]。養(yǎng)基是用培養(yǎng)過一種細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)另一種細胞，兩種胞因子可以交流，其優(yōu)點是可以消除目的細胞對條件細胞對目的細胞的作用[63]。此法簡便易行，但是時間上的不統(tǒng)嚴格來說，這種方法介于單層細胞培養(yǎng)和共培養(yǎng)之間，是

太原理工大學(xué)博士研究生學(xué)位論文的共培養(yǎng)體系[65]。Transwell 小室底部的膜將上下層細胞分開，膜0μm，一般為 0.4μm，細胞不能自由通過此膜，但細胞因子可以自通過此膜進行信息交流。嵌入式細胞共培養(yǎng)法是目前應(yīng)用最多的共培養(yǎng)法可用于各種生長狀態(tài)的細胞，其優(yōu)點是便于分離 2 種細察其各自的細胞狀態(tài)變化，以探討一種細胞對另一種細胞的作用。ranswell 小室共培養(yǎng)處理過的內(nèi)皮細胞和上皮細胞，探討了多壁碳在心血管疾病中的作用。張明[67]通過分離、培養(yǎng)人纖維環(huán)（AF）細分別吸取第 3 代 AF 細胞和 BMSCs，按 1：1 比例分別植于 Tra養(yǎng)系統(tǒng)中，，下室植入 BMSCs，上室植入 AF 細胞，以建立 2 種細胞型，從而探討了共培養(yǎng)體系對 AF 細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成的影Cs 是否具有向 AF 細胞分化的能力。
【學(xué)位授予單位】：太原理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

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本文編號：2613374