【摘要】：隨著組織工程技術的發(fā)展,利用肝細胞和生物材料體外構建類肝組織體為肝臟疾病的治療帶來了希望。但是,在目前肝組織工程的研究中,仍然存在著兩個主要問題,一個是肝細胞體外培養(yǎng)中的極性丟失問題,另一個是物質(zhì)傳遞限制導致的細胞壞死問題。本研究根據(jù)肝竇的結構特征,以肝實質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞和凝膠基質(zhì)材料為基本元素,構建一個體外類肝組織體,探索解決肝組織工程領域的核心問題。具體來說,我們以海藻酸凝膠作為犧牲材料,通過對其進行微加工成型、表面修飾、包埋、去凝膠化等過程操作,構建一個基于凝膠基質(zhì)的微流控通道系統(tǒng)。在微流控通道內(nèi)種植人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs),經(jīng)過三維培養(yǎng),形成一個近似于體內(nèi)血管壁的內(nèi)皮細胞層。在此基礎上,將肝實質(zhì)細胞裝載到外圍凝膠基質(zhì)中,形成一個結構有序的共培養(yǎng)體系,研究該體系對物質(zhì)傳遞和肝細胞功能的影響。具體研究內(nèi)容如下:(1)構建一個基于海藻酸犧牲材料的微通道體系。首先通過流體紡絲法制備海藻酸微型柱狀凝膠,考察二價陽離子、針頭內(nèi)徑和流體流速對海藻酸凝膠形貌及力學性能的影響規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn),使用Ca~(2+)作為交聯(lián)因子,流體流速范圍控制在60-180μL/s的范圍,所制備的柱狀凝膠直徑與打印針頭內(nèi)徑成正相關。然后將該微型柱狀凝膠包埋在外圍基質(zhì)中,考察外圍基質(zhì)的組分對其力學穩(wěn)定性及生物性能的影響。最后,以檸檬酸鈉溶液作為液化劑,將包埋于外圍基質(zhì)體系中的海藻酸凝膠液化后形成微通道。通過考察體系中微通道的結構及性能,篩選出一個快速有效且生物相容的去凝膠化方法。(2)微脈管系統(tǒng)的構建。首先使用殼聚糖(CS)修飾海藻酸鈣凝膠,在其表面形成一層復合膜結構。考察了殼聚糖與海藻酸鈣凝膠反應時間對復合膜結構及生物性能的影響。反應時間為3-7 min時,可形成5μm-15μm厚度的殼聚糖膜。在修飾后的海藻酸鈣凝膠表面接種HUVECs,培養(yǎng)9天后,形成致密細胞層。經(jīng)細胞增殖、凋亡分析,具有復合膜的海藻酸鈣凝膠(CS/Ca-Alg)可促進細胞增殖,抑制細胞的凋亡。之后將鋪滿內(nèi)皮細胞的CS/Ca-Alg包埋于三維復合凝膠中,使用檸檬酸鈉溶液溶解并形成微脈管結構�？疾鞕幟仕徕c溶液濃度對凝膠完全液化時間及細胞活性的影響,結果顯示15 mM的檸檬酸鈉可在20-40 min內(nèi)將直徑為500-1000μm的海藻酸鈣凝膠完全液化,且可保持細胞活性在80%以上。最后,我們分別對通道內(nèi)物質(zhì)的傳遞做了評價,發(fā)現(xiàn)具有膜結構的微流控通道及脈管系統(tǒng)都可以選擇性的透過分子。(3)體外構建具有脈管系統(tǒng)的類肝組織體。在上述研究工作的基礎上,以人肝癌細胞系(HepG2)為模型,利用該脈管系統(tǒng)組建了一個結構有序的共培養(yǎng)體系。一方面,該脈管系統(tǒng)作為營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸系統(tǒng),為三維體系中的肝細胞代謝提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì),因此解決了僅依靠擴散效應而形成的物質(zhì)傳遞限制問題。另一方面,該脈管系統(tǒng)作為有序共培養(yǎng)體系的架構,為肝細胞極性重建和功能修復提供了一個微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn),包埋在脈管系統(tǒng)中的肝細胞活性顯著增強,肝細胞特定功能的表達,包括白蛋白的分泌以及肝細胞特定基因的表達水平得到了顯著改善。與異物代謝相關的基因CYP1A1、CYP3A4、UGT1A1與GSTA1表達水平分別增加了3.5倍、11.1倍、7.9倍、5.6倍。與合成相關的轉錄因子NDUFA3與GCLM分別增加了2.0、4.2倍。培養(yǎng)5天后,在脈管系統(tǒng)中內(nèi)皮細胞的影響下,肝細胞白蛋白的分泌量增加了2.8倍。綜上所述,本研究提出一種構建微通道和微脈管系統(tǒng)的方法,該脈管結構作為物質(zhì)傳遞系統(tǒng)能夠為組織體中的細胞提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。更重要的是,它可作為一個有序的共培養(yǎng)體系,為肝細胞極性重建和功能修復提供了一個良好的微環(huán)境,為探索肝組織工程的研究提供一個新思路。
【圖文】：

圖 1-1 細胞 A 與細胞 B 直接共培養(yǎng)Fig 1-1 The direct co-culture of the A cell and B cell觸共培養(yǎng)體系觸共培養(yǎng)體系，即將兩種或兩種以上的細胞分別接種于不種載體置于同一培養(yǎng)環(huán)境之中，使不同種類的細胞共用同接觸[58]。主要有條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)法、“爬片式”共培養(yǎng)法（Transwell 小室）等[59-62]。養(yǎng)基是用培養(yǎng)過一種細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)另一種細胞，兩種胞因子可以交流，其優(yōu)點是可以消除目的細胞對條件細胞對目的細胞的作用[63]。此法簡便易行，但是時間上的不統(tǒng)嚴格來說，這種方法介于單層細胞培養(yǎng)和共培養(yǎng)之間，是

太原理工大學博士研究生學位論文的共培養(yǎng)體系[65]。Transwell 小室底部的膜將上下層細胞分開，膜0μm，一般為 0.4μm，細胞不能自由通過此膜，但細胞因子可以自通過此膜進行信息交流。嵌入式細胞共培養(yǎng)法是目前應用最多的共培養(yǎng)法可用于各種生長狀態(tài)的細胞，其優(yōu)點是便于分離 2 種細察其各自的細胞狀態(tài)變化，以探討一種細胞對另一種細胞的作用。ranswell 小室共培養(yǎng)處理過的內(nèi)皮細胞和上皮細胞，探討了多壁碳在心血管疾病中的作用。張明[67]通過分離、培養(yǎng)人纖維環(huán)（AF）細分別吸取第 3 代 AF 細胞和 BMSCs，按 1：1 比例分別植于 Tra養(yǎng)系統(tǒng)中，，下室植入 BMSCs，上室植入 AF 細胞，以建立 2 種細胞型，從而探討了共培養(yǎng)體系對 AF 細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成的影Cs 是否具有向 AF 細胞分化的能力。
【學位授予單位】：太原理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

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本文編號：2613374