【摘要】：研究目的殼聚糖(chitosan)是一種來源廣泛的高分子堿性多糖,具有低毒性、可降解性和良好的生物學(xué)活性,在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)用敷料和載藥系統(tǒng)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。盡管殼聚糖具有低毒性的特點,在應(yīng)用過程中仍有必要建立一種可以對殼聚糖進(jìn)行定量檢測的方法,該方法的建立對殼聚糖醫(yī)用敷料和載藥系統(tǒng)中的含量測定及質(zhì)量控制也具有重要意義。質(zhì)譜(MS)是一種應(yīng)用廣泛的定性、定量分析技術(shù),檢測的是化合物的特異性的質(zhì)荷比(m/z)。殼聚糖是由隨機(jī)分布的脫乙�；瘑误w(N-glucosamine,GlcN)和乙酰化單體(N-acetyl-glucosamine,GlcNAc)組成的分子量大且不均一的共聚物,因此,利用質(zhì)譜技術(shù)對殼聚糖進(jìn)行檢測存在很多挑戰(zhàn)。目前,國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中,利用質(zhì)譜技術(shù)對分子量低于2 kDa的殼寡糖(Chito-oligosaccharide,COS)進(jìn)行分析的報道較多,暫無利用質(zhì)譜技術(shù)對殼聚糖進(jìn)行定性、定量分析的報道。殼聚糖分子中僅含有GlcNAc和GlcN兩種單體,其在質(zhì)譜儀的離子源中可能會發(fā)生源內(nèi)裂解或形成帶多電荷的離子,這些帶電離子形成的規(guī)律可能與殼聚糖的分子量、脫乙酰度和濃度存在相關(guān)性,本研究旨在探究殼聚糖在ESI源中形成的質(zhì)譜圖的規(guī)律,并根據(jù)這一規(guī)律,嘗試建立一種能夠?qū)ぞ厶沁M(jìn)行定性、定量分析的質(zhì)譜方法,為殼聚糖及其相關(guān)材料的應(yīng)用研究提供一種靈敏度高、特異性好、分析速度快的技術(shù)手段。第一章殼聚糖的純化及分子量的測定本研究中通過分子排阻色譜串聯(lián)示差檢測器(SEC-RID)法對9種商品化殼聚糖的分子量進(jìn)行了測定。在商品化殼聚糖的生產(chǎn)過程中可能會有殼寡糖生成,本研究中對粘度范圍(50~800 mPa·s)最大的殼聚糖樣品(chitosan 7)進(jìn)行了純化,并對純化前、后殼聚糖分子量的差異和是否含有殼寡糖進(jìn)行了比較。純化方法分為兩步:(1)在酸性溶液中對殼聚糖進(jìn)行溶解并過濾,該過程可以除去分子量過大或脫乙酰度過低的殼聚糖,(2)在堿性溶液中對殼聚糖進(jìn)行再沉淀,該過程可以除去小分量的殼聚糖。通過SEC-RID法測得9種殼聚糖的重均分子量在106.1~485.1 kDa范圍內(nèi)。在純化前、后Chitosan 7樣品中均未檢測到殼寡糖,重均分子量分別為485.1 kDa和367.7 kDa,經(jīng)純化后殼聚糖的分子量減小約24.20%。SEC法的靈敏度較低,可能無法檢測到殼聚糖樣品中含量較低的殼寡糖,因此需要建立一種靈敏較高的方法對殼寡糖進(jìn)行檢測。第二章殼聚糖脫乙酰度的測定有關(guān)殼聚糖脫乙酰度測定方法的研究有很多,最常用的方法為酸堿滴定法和核磁共振氫譜法,本研究中采用這兩種方法對9種購自不同廠家的殼聚糖樣品的脫乙酰度進(jìn)行了測定,并對這兩種方法測定的結(jié)果進(jìn)行了比較。酸堿滴定法測得9種殼聚糖的脫乙酰度在63.80~86.19%范圍內(nèi),核磁共振氫譜法測得結(jié)果略高,在69.97~89.06%范圍內(nèi),兩種方法測定結(jié)果的偏差在-8.82~-0.80%范圍內(nèi)。文獻(xiàn)報道中普遍認(rèn)為核磁共振氫譜法測得的結(jié)果較為準(zhǔn)確,該方法適用能溶解于酸性溶液的殼聚糖樣品的檢測,檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性不受樣品稱量準(zhǔn)確性的影響,測試前后樣品溶液pH無變化,不會有殼聚糖沉淀析出,但是所需要的儀器及儀器操作方法較復(fù)雜。酸堿滴定法測得的結(jié)果比核磁共振氫譜法測得的結(jié)果低,但是兩種方法測得結(jié)果偏差較小,因此酸堿滴定法可用于殼聚糖的定性分析。酸堿滴定法所需儀器設(shè)備簡單,操作方便,需要對殼聚糖樣品進(jìn)行準(zhǔn)確稱量并準(zhǔn)確判斷滴定終點。第三章UPLC-MS/MS法測定殼聚糖樣品中的殼寡糖殼寡糖(Chito-oligosaccharide,COS)通常是通過對殼聚糖進(jìn)行降解制備得到的,也具有良好的生物學(xué)特性。殼聚糖和殼寡糖都是由GlcNAc單體和GlcN單體組成的聚合度不同的物質(zhì),兩者的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,在質(zhì)譜儀內(nèi)形成的帶電離子可能會互相干擾測定。因此,本研究中建立了靈敏度較高的UPLC-MS/MS方法對殼聚糖和殼寡糖進(jìn)行分離、檢測。聚合度(DP)為1~7的殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫分別通過XBRIDGE BEH 130 C18色譜柱和BEH Amide色譜柱進(jìn)行評價。XBRIDGE BEH 130 C18色譜柱是一種反相色譜柱,殼寡糖(DP 1~7)在該色譜柱上的保留時間分別為0.48、0.45、0.43、0.41、0.40、0.39和0.38 min,殼聚糖的保留時間為0.30 min。雖然該方法未能完全分離殼寡糖和殼聚糖,但是可用于這兩種樣品的定性分析。在殼聚糖樣品中檢測到殼寡糖的離子對,但是保留時間為0.30 min,說明:(1)殼聚糖樣品中的殼寡糖含量低于檢出下限;(2)殼聚糖在質(zhì)譜的ESI源內(nèi)發(fā)生了源內(nèi)裂解,生成了殼寡糖的離子對。BEH Amide色譜柱是一種親水作用色譜柱,適用于多肽和多糖的分析。殼寡糖(DP 1~5)在該色譜柱上的保留時間分別為2.98、3.32、3.58、3.79和4.10 min。該方法可完全分離聚合度為1~5的殼寡糖,但是未能洗脫、檢測到聚合度大于5的殼寡糖。在殼聚糖樣品中未檢測到聚合度為1~5的殼寡糖。由于殼聚糖的聚合度大于5,該方法也未能洗脫殼聚糖,因此未檢測到殼聚糖發(fā)生源內(nèi)裂解后生成的殼寡糖離子對。但是,在高聚合度的殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品中檢測到的低聚合度的殼寡糖的離子對,說明殼寡糖在質(zhì)譜ESI源內(nèi)也易發(fā)生源內(nèi)裂解。第四章殼寡糖和殼聚糖在ESI源中形成的質(zhì)譜圖的規(guī)律解析在第三章研究中發(fā)現(xiàn)了殼聚糖和殼寡糖在ESI源內(nèi)都易裂解,本研究通過Synapt G2-Si Q-TOF高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)對殼寡糖和殼聚糖在100~1200 m/z范圍內(nèi)的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢測,并對兩者在ESI源內(nèi)形成帶電離子的規(guī)律進(jìn)行解析。通過對得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):殼寡糖和殼聚糖在ESI源易發(fā)生源內(nèi)裂解,且裂解規(guī)律相似;9種不同來源的殼聚糖樣品,在ESI源內(nèi)裂解后,檢測到了相同的質(zhì)譜圖,質(zhì)譜圖中的離子主要是由殼聚糖的脫乙酰化單體(GlcN,161.07 Da)和乙�；瘑误w(GlcNAc,203.08 Da)組成的,部分離子會發(fā)生源內(nèi)脫水,說明殼聚糖在ESI源內(nèi)的裂解主要是由糖苷鍵的斷裂和脫水造成的。隨著質(zhì)荷比的增加,離子的響應(yīng)值下降,當(dāng)質(zhì)荷比大于1200 m/z時,檢測到的離子的響應(yīng)值均較低,說明大部分殼聚糖分子在ESI源內(nèi)發(fā)生了裂解,豐度最高的帶電離子主要由不同聚合度的GlcN單體構(gòu)成。其中毛細(xì)管電壓是影響源內(nèi)裂解最主要的因素,當(dāng)毛細(xì)管電壓為2.4 kV時各個離子的響應(yīng)值最高。第五章殼聚糖的質(zhì)譜特征與脫乙酰度的相關(guān)性研究殼聚糖在ESI源內(nèi)易發(fā)生源內(nèi)裂解,生成的由GlcN單體組成的特征離子的相對豐度最高,本實驗中主要對這些離子進(jìn)行檢測。為避免這些帶電離子在碰撞室內(nèi)進(jìn)一步裂解生成相同的帶電離子,而相互干擾測定,本實驗中建立了一種假二級的檢測方法(UPLC-pseudo-MS/MS法),在碰撞室中未提供碰撞能量,檢測的離子對為323.17→323.17(2 GlcN),484.22→484.22(3 GlcN),645.28→645.28(4 GlcN),806.33→806.33(5 GlcN)和967.20→967.20(6 GlcN)m/z,并對這些離子對的響應(yīng)值與殼聚糖脫乙酰度之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究。通過對五個離子對的響應(yīng)值進(jìn)行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)雖然9種殼聚糖樣品的脫乙酰度和分子量各不相同,但是在9種殼聚糖樣品中五個離子對相對豐度都接近100.00:63.12:43.85:27.04:11.82,說明殼聚糖在ESI源內(nèi)裂解生成不同質(zhì)荷比的帶電離子的比例是相近的。帶電離子323.17(2 GlcN),484.22(3 GlcN),645.28(4GlcN),806.33(5 GlcN)和967.20(6 GlcN)m/z的響應(yīng)值與~1H NMR法和酸堿滴定法測得脫乙酰度間的相關(guān)系數(shù)R分別為0.9578,0.9612,0.9795,0.9891,0.9765和0.9878,0.9722,0.9807,0.9786,0.9648,脫乙酰化單體組成的離子的響應(yīng)值與殼聚糖的脫乙酰度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,該研究提供了一種新型的殼聚糖脫乙酰度測定的方法,該方法靈敏度高,分析時間短,適用于可溶性殼聚糖的脫乙酰度的測定,但是該方法需要利用已知脫乙酰度的殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)品來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時還需要對殼聚糖樣品進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。第六章殼聚糖定量分析方法建立的初步探究在第五章研究中,發(fā)現(xiàn)殼聚糖經(jīng)源內(nèi)裂解后生成的各個離子比例是相近的,對于同一殼聚糖樣品來說,這些離子的響應(yīng)值可能與殼聚糖的濃度存在相關(guān)性。本研究中通過建立的UPLC-psedo-MS/MS法對響應(yīng)值較高且受到干擾較小的484.22→484.22 m/z離子進(jìn)行了檢測,并考察該離子的響應(yīng)值與殼聚糖濃度間的相關(guān)性。并利用建立的質(zhì)譜方法對殼聚糖復(fù)合止血貼和商品化殼聚糖止血粉中的殼聚糖含量進(jìn)行了測定;然后嘗試對加入生物基質(zhì)的殼聚糖樣品進(jìn)行提取、檢測。經(jīng)驗證,在純?nèi)軇┲?殼聚糖在0.1~10μg/mL濃度范圍內(nèi)與檢測離子的響應(yīng)值間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。兩種殼聚糖止血敷料通過1%乙酸溶液溶解、提取后,利用建立的方法進(jìn)行檢測,測得殼聚糖復(fù)合止血貼中殼聚糖的含量為19%;測得殼聚糖止血粉中殼聚糖的含量為120%,比實際值高20%。在該研究中發(fā)現(xiàn):殼聚糖復(fù)合材料中殼聚糖的提取方法和殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的脫乙酰度的差異是影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性的兩個重要因素。殼聚糖是一種分子量高、極性大的化合物,生物樣品中的殼聚糖的提取方法的建立存在很多挑戰(zhàn),本研究中初步探究了利用沉淀蛋白法提取生物基質(zhì)中的殼聚糖的可行性,但是提取回收率較低。生物樣品中的殼聚糖的提取方法需要進(jìn)一步的優(yōu)化。結(jié)論本研究首先通過傳統(tǒng)方法對殼聚糖的脫乙酰度和分子量進(jìn)行了測定。然后建立了可用于分離、檢測殼寡糖和殼聚糖的UPLC-MS/MS方法,該方法靈敏度高、特異性好,可用于9種殼聚糖樣品中的殼寡糖的檢測分析。在殼寡糖和殼聚糖的質(zhì)譜圖的分析研究中,首次闡明了殼聚糖在ESI源內(nèi)形成帶電離子的規(guī)律:殼聚糖分子在ESI源內(nèi)的裂解主要有糖苷鍵的斷裂和脫水,生成的帶電離子的質(zhì)荷比可通過公式m/z=m·D+n·A+0/1·H_20+H~+(m,n∈N,D=161.07 Da,A=203.08 Da)計算,絕大多數(shù)帶電離子的質(zhì)荷比小于1200 m/z,說明殼聚糖的源內(nèi)裂解過程較徹底。通過UPLC-pseudo-MS/MS方法對殼聚糖源內(nèi)裂解生成的離子進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)殼聚糖源內(nèi)裂解生成的由GlcN單體組成的離子的響應(yīng)值與殼聚糖的脫乙酰度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。利用已知脫乙酰度的殼聚糖樣品擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線后,可對未知殼聚糖樣品的脫乙酰度進(jìn)行測定,該方法是一種新型的殼聚糖脫乙酰度測定方法,與傳統(tǒng)方法相比較具有分析時間短、靈敏度高的特點。殼聚糖源內(nèi)裂解產(chǎn)生的特征離子的響應(yīng)值與殼聚糖的濃度之間也呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,本研究中利用這一規(guī)律建立了UPLC-pseudo-MS/MS方法,該方法可用于殼聚糖及其制備的材料的定性和定量分析。
【圖文】：

前 言甲殼素（結(jié)構(gòu)式如圖 1 所示）是地球上最豐富的自然資源之一，廣泛分布于植物、海洋無脊柱生物、昆蟲的外骨骼、真菌的細(xì)胞壁和一些微生物中[1, 2]。甲殼素是一種線性高分子聚合物，主要由脫乙�；瘑误w（N-glucosamine, GlcN）和乙酰化單體（N-acetyl-glucosamine, GlcNAc）通過糖苷鍵隨機(jī)組合而成，它難溶于水及常見的有機(jī)試劑，，有文獻(xiàn)報道一些特殊的溶劑，如(DMAc)-LiCl（二甲基乙酰胺-氯化鋰），可用作甲殼素的溶劑[3]。在高溫、強(qiáng)堿性條件下可使甲殼素中的乙�；瘑误w發(fā)生脫乙酰化反應(yīng)，制備得到殼聚糖[4-6]。殼聚糖也是一種線性高分子聚合物，它與甲殼素的主要區(qū)別在于分子中的脫乙�；瘑误w的百分含量（即脫乙酰度，Degree of Deacetylation, DD）不同，一般將脫乙酰度大于 50%的甲殼素稱為殼聚糖。由于殼聚糖分子中 50%以上的單體含有氨基，是一種堿性多糖，易溶解于 pH 低于6.0 的酸性溶液中，呈現(xiàn)陽離子特性[7, 8]。通過提取生物來源的甲殼素，經(jīng)脫乙酰化反應(yīng)和純化后制備得到的殼聚糖通常由一系列聚合度接近的大分子組成，脫乙酰化單體和乙�；瘑误w隨機(jī)分布于這些分子中，結(jié)構(gòu)式如圖 1 所示。

右旋葡聚糖 6 kDa（A）、670 kDa（B）、Chitosan 7 純化前（C）、后（D）和空白溶（E）的 SEC 色譜圖 SEC chromatograms of dextran (6 kDa (A), 670 kDa (B)), Chitosan 7 (C), purified Chito7 (D) and solvent (E).4.2 殼聚糖樣品及純化后殼聚糖分子量測定種不同分子量的右旋葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品在 SEC 系統(tǒng)中的保留時間如表 1.2 中 kDa 和 670 kDa 右旋葡聚糖的色譜圖如圖 1.1（A& B）所示。在分子排阻化合物的分子量的對數(shù)與保留時間呈負(fù)相關(guān)，利用 LC solution 工作站的旋葡聚糖的保留時間和其分子量擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù) R 為 0.9977，的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算 5 種右旋葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量（如表 1.2 所示），與理差在-13.57 ~ 17.93%范圍內(nèi)。表 1.2 五種分子量的右旋葡聚糖在 SEC 中保留時間和重均分子量計算值Table 1.2 RT and calculated Mw of 5 kinds of dextranRT (min) Mw 計算值(Da) Mw 理論值(Da) RE (%)7.23 618537 670000 -7.68
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2608608