【摘要】：生物體內(nèi)存在各種各樣的內(nèi)源性活性物種以及潛在的腫瘤標(biāo)志物。這些物質(zhì)的種類(lèi)及含量在正常細(xì)胞與非正常細(xì)胞內(nèi)是存在差異的。近年來(lái),學(xué)術(shù)界開(kāi)發(fā)了諸多生物檢測(cè)技術(shù)。然而,鑒于生物體內(nèi)環(huán)境存在多樣性與復(fù)雜性,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性低、選擇性差。因此,我們發(fā)現(xiàn)仍有必要去開(kāi)發(fā)選擇性好、靈敏度高準(zhǔn)確性高的分析方法。熒光探針可以選擇性地將分析對(duì)象的化學(xué)信息連續(xù)地轉(zhuǎn)變?yōu)榉治鰞x器易測(cè)量的熒光信號(hào)。當(dāng)周?chē)h(huán)境變化時(shí),熒光分子探針的發(fā)射波長(zhǎng)及強(qiáng)度會(huì)發(fā)生改變,從而將反映出環(huán)境的特征或環(huán)境中存在的某種特定信息。借助這些光學(xué)信息,可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體內(nèi)待測(cè)物的高靈敏、選擇性可視化分析。作為熒光探針中重要組成部分,有機(jī)小分子熒光探針具有設(shè)計(jì)性強(qiáng)、選擇性高、準(zhǔn)確性好、響應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn),在細(xì)胞及動(dòng)物活體檢測(cè)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。本論文從小分子熒光探針的設(shè)計(jì)合成及生物應(yīng)用兩個(gè)方面出發(fā),以NBD-Cl作為母體熒光基團(tuán),設(shè)計(jì)合成了多個(gè)探針,并分別用于檢測(cè)和監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子和腫瘤標(biāo)志物等。具體工作如下:第一章:緒論簡(jiǎn)單介紹了一下熒光探針的應(yīng)用進(jìn)展、選題意義與主要研究?jī)?nèi)容第二章:講述用于檢測(cè)酮戊二酸的小分子探針的設(shè)計(jì)合成及其生物體內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用。α-酮戊二酸(α-KA)的檢測(cè)通常存在低的靈敏度,不可見(jiàn)的顏色變化和易與表面活性劑發(fā)生復(fù)合的缺點(diǎn),這就限制了對(duì)于生物樣品中α-KA的準(zhǔn)確性,高靈敏的定性和定量檢測(cè)。與常規(guī)的傳感機(jī)制不同,我們?cè)O(shè)計(jì)出一種結(jié)合吸收紅移(不是發(fā)射)的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)的特殊機(jī)制,并設(shè)計(jì)了同時(shí)用于生物樣品中α-KA熒光檢測(cè),吸收比率和比色檢測(cè)的簡(jiǎn)單而多功能的探針。無(wú)需任何表面活性劑,PET的有效抑制確保了探針強(qiáng)的熒光開(kāi)啟(60倍)和低的檢出限(0.9mM)。紫外區(qū)域大的吸收紅移(100 nm)所引起的明顯顏色變化使得能夠通過(guò)肉眼進(jìn)行α-KA的比色分析。同時(shí),這種大的吸收紅移也有助于比率檢測(cè),從而準(zhǔn)確定量復(fù)雜生物樣品中的α-KA。用這種探針,我們首次實(shí)現(xiàn)了血清,活細(xì)胞和組織樣品中α-KA的比率檢測(cè),肉眼監(jiān)測(cè)以及成像。第三章:講述用于檢測(cè)氧化應(yīng)激(ClO-和H_2S)的小分子探針的設(shè)計(jì)合成及其生物體內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用。ClO-/H_2S穩(wěn)態(tài)在胃組織的損傷和修復(fù)中起著關(guān)鍵的作用,但是由于在高酸性胃環(huán)境中進(jìn)行原位分析的挑戰(zhàn),對(duì)于這種穩(wěn)態(tài)的研究很少。這里,我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新的包括可控的光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移(PET)和電荷推挽開(kāi)關(guān)的H+激活光學(xué)機(jī)制,開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)單而多功能的探針(Z)-4-(2-亞芐基肼基)-7-硝基苯并[c][1,2,5]惡二唑(BNBD)。首先,探針BNBD(關(guān))被高酸性介質(zhì)質(zhì)子化以觸發(fā)強(qiáng)的熒光(開(kāi))。然后,ClO-或者H_2S分析物與質(zhì)子化的BNBD反應(yīng),導(dǎo)致分別由C=N的快速氧化(50 S)和硝基還原而產(chǎn)生的超靈敏(ClO-:2.7 n M;H_2S:6.9 nM)的熒光猝滅。通過(guò)吸光度/顏色的邏輯鑒別(ClO-:300nm/無(wú)色;H_2S:400 nm/橙色)開(kāi)發(fā)了用于原位定量檢測(cè)胃粘膜與中ClO-/H_2S的方法。首次實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源性H_2S,ClO-/H_2S穩(wěn)態(tài)及胃粘膜病理學(xué)的原位定量檢測(cè),克服了高酸性條件下ClO-/H_2S分析的挑戰(zhàn)并實(shí)現(xiàn)了ClO-/H_2S的原位組織定量分析。與粘膜損傷評(píng)估相結(jié)合,這項(xiàng)工作證實(shí)了ClO-/H_2S對(duì)胃粘膜(50-90mm深處)的損傷/修復(fù)作用,這可能有助于輔助診斷由氧化應(yīng)激引起的胃病。第四章:講述了用于檢測(cè)pH的小分子探針的設(shè)計(jì)合成及其生物體內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用。細(xì)胞可以在非常精確的范圍內(nèi)控制其pH變化。pH在細(xì)胞自噬和凋亡中起重要作用。有證據(jù)表明腫瘤的內(nèi)部環(huán)境是被酸化了的。雖然細(xì)胞中的酸化已被研究,但復(fù)雜細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下多種刺激因子的生物學(xué)效應(yīng)尚未被完全闡明。到目前為止,只有很少的pH探針有寬的檢測(cè)范圍,這就迫切需要開(kāi)發(fā)一種寬范圍pH探針。在這里,我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新的熒光探針(CM-BHNBD)用于線粒體和粘膜內(nèi)酸化的實(shí)時(shí)檢測(cè)。探針通過(guò)H+驅(qū)動(dòng)的PET-TICT(光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移-扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移)機(jī)制對(duì)pH進(jìn)行響應(yīng),并且可以線性地響應(yīng)pH在寬的酸度單位中的變化:7.00-2.00伴隨有140倍的熒光增強(qiáng)。該探針還具有優(yōu)異的膜通透性,良好的光穩(wěn)定性和可忽略的細(xì)胞毒性。探針成功應(yīng)用于量化HeLa細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)剝奪和氧化應(yīng)激同時(shí)刺激下的酸化。我們的研究結(jié)果表明線粒體pH在酸化過(guò)程中處于動(dòng)態(tài)波動(dòng)狀態(tài),這表明了細(xì)胞自噬和凋亡之間存在潛在的串?dāng)_效應(yīng)。我們還使用該探針通過(guò)操縱細(xì)胞質(zhì)子泵來(lái)量化胃和食道的粘膜內(nèi)pH變化。我們的探針有望被用于監(jiān)測(cè)生物醫(yī)學(xué)研究的細(xì)胞內(nèi)/粘膜內(nèi)的酸化。第五章:總結(jié)與展望
【圖文】：

圖 1-1 幾種常見(jiàn)的熒光團(tuán)Fig. 1-1 Several common fluorophore1.3 選題意義與主要研究?jī)?nèi)容隨著社會(huì)的發(fā)展，，當(dāng)代社會(huì)對(duì)生物醫(yī)學(xué)和生物分子學(xué)的需求，有機(jī)小分子熒光探針的研發(fā)已成為當(dāng)代社會(huì)的主流，也是當(dāng)代社會(huì)的需求。因此本人將主要從有機(jī)小分子熒光探針的設(shè)計(jì)合成與實(shí)際應(yīng)用兩個(gè)方面出發(fā)，以 NBD-Cl 小分子為母體環(huán)，設(shè)計(jì)合成多種探針，并分別用來(lái)檢測(cè)各種小分子物質(zhì)，構(gòu)建了多功能的熒光傳感器。具體工作有：（1）設(shè)計(jì)合成用于檢測(cè)酮戊二酸的小分子熒光探針并對(duì)其進(jìn)行生物體內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用。（2）設(shè)計(jì)合成用于檢測(cè)氧化應(yīng)激（ClO-和H2S）的小分子熒光探針并對(duì)其進(jìn)行生物體內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用。（3）設(shè)計(jì)合成用于

利用光致電子轉(zhuǎn)移機(jī)理（PET）使其熒光淬滅；同時(shí)該淬滅基團(tuán)對(duì)待測(cè)物 alpha-酮戊二酸具備良好的反應(yīng)特性，反應(yīng)后要求產(chǎn)物的分子前線軌道能量有較大幅度改變致 PET 機(jī)理被阻止，從而釋放出強(qiáng)熒光信號(hào)并提高靈敏度；另外前線軌道能量差值應(yīng)有所減小，以使吸收波長(zhǎng)紅移，從而顯示出可見(jiàn)光顏色為肉眼觀測(cè)提供保證。熒光母環(huán) NBD 分子具有長(zhǎng)波吸收和發(fā)射、高量子產(chǎn)率、優(yōu)良的細(xì)胞穿透性、低毒性以及良好的可獲得性等優(yōu)點(diǎn)。alpha-酮戊二酸分子結(jié)構(gòu)中羧酸鄰位存在一羰基，該基團(tuán)可與給電子基團(tuán)（如-氨基）反應(yīng)，改變基團(tuán)的電子供效。因此，以 NBD 作母體發(fā)光環(huán)，將 NBD-Cl 分子 7 號(hào)位的元素氯取代成為肼基，得到本課題熒光/紫外分子探針（即探針 HNBD），然后將其應(yīng)用于生物樣本檢測(cè)，機(jī)理如圖 2-1 所示。
【學(xué)位授予單位】：青海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R318

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本文編號(hào)：2585221