發(fā)布時(shí)間：2020-02-10 02:13

【摘要】：第一部分人工關(guān)節(jié)鈦假體表面陰極弧沉積含氮二氧化鈦薄膜的制備及表征測試 目的：利用真空脈沖磁過濾陰極弧等離子體制備二氧化鈦及含氮二氧化鈦薄膜，并對其表面特征進(jìn)行檢測。方法：采用真空脈沖磁過濾陰極弧等離子體二氧化鈦及含氮二氧化鈦薄膜，分別采用純氧氣及氧/氮混合氣氛，進(jìn)行沉積；技術(shù)參數(shù)為：直流電壓40V、負(fù)偏壓-500V；脈沖占空比15%、脈沖頻率7Hz、脈沖寬度2000μs；沉積時(shí)間2小時(shí)。樣品摻氮后，于450℃熱處理30min。未摻氮的純鈦片做為空白對照。采用X線光電子能譜對表面元素組成進(jìn)行分析；測量三組樣品的接觸角；采用Surpass電位運(yùn)動分析儀測量三組樣品表面的Zeta電位。結(jié)果：采用陰極弧等離子體沉積技術(shù)未明顯改變鈦基體的表面形貌，并可成功將氮元素沉積于二氧化鈦薄膜表面；純鈦組、二氧化鈦組及含氮二氧化鈦薄膜組表面的接觸角分別為88.1±1.5°、41.5±5.6°及38.4±5.0°；在摻氮后中性或偏堿性的環(huán)境下，含氮二氧化鈦薄膜表面有更多負(fù)電荷。結(jié)論：采用真空磁過濾陰極弧等離子體沉積技術(shù)，可以成功將氮元素沉積于二氧化鈦薄膜中，對鈦基體表面的二氧化鈦薄膜進(jìn)行改性。在不影響鈦基體表面形態(tài)的情況，氮元素的成功的沉積到薄膜中，并改善了鈦基體的表面親水性；在生理pH下使鈦基體呈現(xiàn)較多的負(fù)電荷。 第二部分陰極弧沉積含氮二氧化鈦薄膜對成骨細(xì)胞粘附的影響 目的：研究探索陰極弧沉積含氮二氧化鈦薄膜對成骨細(xì)胞粘附的影響。方法：采用陰極弧沉積制備二氧化鈦及含氮二氧化鈦薄膜；將一定密度的MG63成骨細(xì)胞接種于不同樣品表面，于2、4、6、12h終止培養(yǎng)，采用CCK-8法定量分析四個(gè)時(shí)間點(diǎn)MG63細(xì)胞在材料表面粘附的數(shù)量；于2、6、12h終止培養(yǎng)采用DAPI對三個(gè)時(shí)間點(diǎn)在材料表面粘附的MG64細(xì)胞核進(jìn)行染色，觀察粘附于材料表面細(xì)胞數(shù)量；于2、6、12、24h終止培養(yǎng)，對四個(gè)時(shí)間點(diǎn)在材料表面粘附的MG64細(xì)胞進(jìn)行鬼筆環(huán)肽及DAPI雙染，動態(tài)觀察MG63細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架蛋白的變化；掃描電鏡觀察24h成骨細(xì)胞在不同樣品表面的形態(tài)；接種細(xì)胞后培養(yǎng)24h，用移液管槍頭劃傷細(xì)胞層，繼續(xù)培養(yǎng)24h，采用鬼筆環(huán)肽及DAPI雙染，觀察細(xì)胞在不同樣品表面的遷移。采用定量RT-PCR檢測2、6、12、24h MG63成骨細(xì)胞Integrin-β1基因表達(dá)水平；結(jié)果：4、6、12h，含氮二氧化鈦薄膜表面粘附的MG63細(xì)胞明顯多于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；動態(tài)細(xì)胞形態(tài)及骨架蛋白觀察顯示，含氮二氧化鈦表面的成骨細(xì)胞較早表達(dá)細(xì)胞骨架蛋白；掃描電鏡顯示含氮二氧化鈦薄膜的MG63細(xì)胞，更加平坦，且細(xì)胞鋪展面積大；含氮二氧化鈦薄膜表面有較多MG63細(xì)胞遷徙至劃傷區(qū)域的中心；在培養(yǎng)12h后，二氧化鈦組及含氮二氧化鈦薄膜表面MG63細(xì)胞Integrin-β1基因表達(dá)較純鈦組增加明顯，但二氧化鈦組與含氮二氧化鈦薄膜間無明顯差異；結(jié)論：含氮二氧化鈦薄膜能夠明顯的促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附及遷移。其可能機(jī)制是生理pH下使薄膜表面負(fù)電荷增多，通過粘附相關(guān)蛋白吸附及構(gòu)象的改變，，促進(jìn)了成骨細(xì)胞表面整合素的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)了成骨細(xì)胞的粘附和遷移，表面陰極弧沉積含氮二氧化鈦薄膜可以增加其生物活性。 第三部分陰極弧沉積含氮二氧化鈦薄膜對成骨細(xì)胞增殖的影響 目的：研究探索陰極弧沉積含氮二氧化鈦薄膜對成骨細(xì)胞增殖的影響。方法：采用陰極弧沉積制備二氧化鈦及含氮二氧化鈦薄膜；將一定密度的MG63成骨細(xì)胞接種于不同樣品表面，采用CCK-8定量分析1、4、7天MG63細(xì)胞在不同樣品表面增殖數(shù)量；通過吖啶橙對1、4、7天三組樣品表面的MG63細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察成骨細(xì)胞的增殖情況；流式細(xì)胞儀分析1、4、7天成骨細(xì)胞在不同樣品表面細(xì)胞周期情況。結(jié)果：培養(yǎng)4天后，含氮二氧化鈦薄膜表面的細(xì)胞增殖活性高于純鈦組；培養(yǎng)7天時(shí)，含氮二氧化鈦薄膜表面細(xì)胞數(shù)量多于純鈦組及二氧化鈦組。吖啶橙染色結(jié)果與CCK-8結(jié)果一致；在培養(yǎng)4天時(shí)，含氮二氧化鈦薄膜表面的MG63細(xì)胞G0/G1的百分比明顯低于其余兩組，而S期及G2/M期的比例明顯升高。結(jié)論：陰極弧沉積含氮二氧化鈦薄膜能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，可能的機(jī)制是摻氮使二氧化鈦在生理pH下呈負(fù)電位，增加或改變吸附蛋白的性質(zhì)，促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖；調(diào)節(jié)增殖的機(jī)制可能與加速細(xì)胞周期中S期、G2/M期有關(guān)。 第四部分陰極弧沉積含氮二氧化鈦薄膜對成骨細(xì)胞分化的影響 目的：研究探索陰極弧沉積含氮二氧化鈦薄膜對成骨細(xì)胞分化的影響。方法：采用陰極弧沉積制備二氧化鈦及含氮二氧化鈦薄膜；將一定密度的MG63成骨細(xì)胞接種于不同樣品表面，于1、4、7天收集樣本，檢測堿性磷酸酶的活性；采用定量RT-PCR檢測1、4、7成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物堿性磷酸酶、I型膠原基因的表達(dá)情況；采用免疫熒光染色對7、10天骨橋蛋白進(jìn)行染色，同時(shí)采用Western-blot檢測骨橋蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：培養(yǎng)至4、7天，含氮二氧化鈦薄膜及二氧化鈦表面的成骨細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)較純鈦組明顯增高，但含氮二氧化鈦薄膜與二氧化鈦組成骨細(xì)胞堿性磷酸酶無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；培養(yǎng)4天后，含氮二氧化鈦薄膜表面的MG63成骨細(xì)胞堿性磷酸酶基因表達(dá)高于純鈦組及二氧化鈦組；培養(yǎng)7天后，只有含氮二氧化鈦薄膜與純鈦組之間MG63成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶基因表達(dá)量有顯著差異；培養(yǎng)4天后，含氮二氧化鈦薄膜表面的MG63成骨細(xì)胞I型膠原基因表達(dá)高于純鈦組及二氧化鈦組，含氮二氧化鈦薄膜雖高于二氧化鈦組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；培養(yǎng)7天后，三組樣品表面MG63細(xì)胞I型膠原的表達(dá)量都明顯增加，含氮二氧化鈦薄膜明顯高于其余兩組；培養(yǎng)7天時(shí)三組的骨橋蛋白表達(dá)量少；至第10天，OPN的表達(dá)增多，含氮二氧化鈦薄膜表面MG63成骨細(xì)胞骨橋蛋白表達(dá)高于純鈦組及二氧化鈦組，免疫熒光染色與Western-blot結(jié)果基本一致；結(jié)論：含氮二氧化鈦薄膜不僅能促進(jìn)MG63細(xì)胞早期成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)水平，同時(shí)也提高了中晚期分化及礦化相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)水平，表明陰極弧沉積含氮二氧化鈦薄膜能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化及礦化。
【圖文】：

圖 1 純鈦組(A)、二氧化鈦組(B)、含氮二氧化鈦組(C)樣品表面形貌掃描電鏡結(jié)果(Bar=20μm由掃面電鏡結(jié)果(圖 1)可知，純鈦組樣品表面略有些小溝，可能與樣品碳化硅拋光有關(guān)，體上較為光滑；二氧化鈦組及含氮二氧化鈦組樣品表面形貌相似，有少量點(diǎn)狀凹陷；說明采極弧等離子體沉積技術(shù)未明顯改變鈦基體的表面形貌。、樣品表面元素分析

圖 2 二氧化鈦組及含氮二氧化鈦薄膜組 XPS 全譜圖(A)；含氮二氧化鈦薄膜表面 Ti2p、N1s、O1s 的高分辨譜(B)；N 元素高分辨曲線擬合圖(C)圖 2 顯示了二氧化鈦及二氧化鈦薄膜表面的元素組成 X 射線光電子能譜的結(jié)果。由圖 2可知，兩組樣品表面元素組成基本一致，主要的特征峰有 Ti3p、C1s、Ti2p 及 O1s，其結(jié)合能分別為 37eV、285eV、459eV 及 531eV。樣品表面的 C1s 主要是由于丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑清洗及吸附空氣 CO2所致。仔細(xì)觀察二氧化鈦薄膜 XPS 全譜圖，可以發(fā)現(xiàn)在結(jié)合能大約 400 eV 處有個(gè)弱峰，即為 N1s 的特征峰。說明陰極弧沉積技術(shù)成功制備了含氮的二氧化鈦薄膜。圖 2B 為含氮二氧化鈦薄膜表面 Ti2p、N1s、O1s 的高分辨譜。其中 Ti2p 能級的高分辨掃描圖，在 459.15 和464.9eV 有兩個(gè)擬合峰，其分別對應(yīng)于 Ti2p1/2 及 Ti2p3/2 軌道同 O1s 軌道形成 Ti-O 化學(xué)鍵的結(jié)合能。圖 2B 中 O1s 能級的高分辨圖中只有一個(gè)特征峰，其結(jié)合能為 530.6eV，其對應(yīng)于 O1s 軌道與 Ti2p 軌道形成的 Ti-O 鍵的結(jié)合能。由 XPS 結(jié)果中 Ti 及 O 的軌道結(jié)合能可以確定，含氮二氧化鈦薄膜表面 Ti2p 及 O1s 的化合態(tài)分別為 Ti4+及 O2-，從而可以進(jìn)一步確定二氧化鈦的存在。圖 2C 為對 N1s 能級進(jìn)行 Gaussian 擬合，分別于 396.82、400.32、402.18eV 三處出現(xiàn)特征峰位。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2578022