【摘要】：研究背景 心臟瓣膜疾病是一類由各種原因引起的瓣膜結(jié)構(gòu)破壞和功能失調(diào)并嚴(yán)重危害人類健康的疾病，人工心臟瓣膜置換是其主要治療方法，全世界每年逾45萬例患者接受換瓣治療。目前臨床上使用的人工心臟瓣膜主要分為兩類：機(jī)械瓣膜和生物瓣膜。雖然它們都能部分替代原有瓣膜的功能從而改善患者生活質(zhì)量并延長患者生命，但是由于其自身材料和結(jié)構(gòu)等缺陷難以完美替代自身瓣膜并存在多種并發(fā)癥和后遺癥。機(jī)械瓣膜置換后需要終生抗凝，因抗凝不當(dāng)易引起出血、血栓和栓塞；生物瓣膜的血流動力學(xué)性能好，但因鈣化和衰壞易導(dǎo)致生物瓣功能障礙，需要10到15年后再次進(jìn)行瓣膜置換。因此研制有生長和修復(fù)能力的組織工程心臟瓣膜（TEHV）已成為心臟瓣膜研制的主要方向。然而，目前研制的TEHV體內(nèi)移植后均無法適應(yīng)體內(nèi)復(fù)雜的力學(xué)環(huán)境，不能耐受高壓、高速血流的沖擊。 生物力學(xué)信號是心臟瓣膜生長發(fā)育過程中一種重要的細(xì)胞外調(diào)控信號，使瓣膜細(xì)胞隨著發(fā)育逐步適應(yīng)高壓高速的血流力學(xué)環(huán)境。如何系統(tǒng)模擬瓣膜生理發(fā)育過程中逐漸增高的壓力和血流速度變化等力學(xué)信號調(diào)控過程，，在TEHV體外構(gòu)建的過程中從種子細(xì)胞培養(yǎng)分化開始就進(jìn)行仿生性力學(xué)漸進(jìn)性系統(tǒng)訓(xùn)練、調(diào)控，逐步增強(qiáng)種子細(xì)胞適應(yīng)高壓、高速血流沖擊的能力，對研究TEHV及其它須面對體內(nèi)復(fù)雜應(yīng)力環(huán)境的組織工程器官具有重大意義。 研究目的 本課題研究漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)對MSCs活性、功能和分化等的影響及相關(guān)機(jī)制，尋找細(xì)胞內(nèi)力學(xué)信號作用的關(guān)鍵分子，為基因改造優(yōu)化種子細(xì)胞提供理論基礎(chǔ)，探索可顯著改善MSCs耐受高壓、高速血流沖擊的仿生性力學(xué)訓(xùn)練系統(tǒng)方案。 研究方法和結(jié)果 第一部分漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)對MSCs活性功能的影響 培養(yǎng)的大鼠MSCs分為6個實驗組分別接受0、5、10和15dyn/cm2剪應(yīng)力及漸進(jìn)性增加剪應(yīng)力0~10和0~15dyn/cm2處理。Brdu法檢測細(xì)胞增殖，劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移，Elisa檢測細(xì)胞分泌，貼壁率檢測細(xì)胞粘附及Tunel檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果：與靜態(tài)培養(yǎng)的MSCs相比，高恒定剪應(yīng)力（15dyn/cm2）提高細(xì)胞增殖率、遷移率和粘附率(P值均0.05)，同時顯著提高M(jìn)SCs分泌VEGF、TGF-β1、bFGF和PDGF細(xì)胞因子水平(P值均0.01)。與單純高剪應(yīng)力（15dyn/cm2）干預(yù)的MSCs相比，0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)提高細(xì)胞增殖率、遷移率和粘附率(P值均0.05)，同時提高M(jìn)SCs分泌VEGF、TGF-β1、bFGF和PDGF細(xì)胞因子水平(P值均0.05)。單純高剪應(yīng)力（15dyn/cm2）干預(yù)的MSCs相比靜態(tài)培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞凋亡率顯著提高(P0.01)，而0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)可以顯著減少細(xì)胞凋亡(P0.01)。 第二部分漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)增強(qiáng)MSCs活性機(jī)制研究 Western-blot檢測PIM-1等目的蛋白表達(dá)，采用siRNA和蛋白抑制劑探索相關(guān)分子機(jī)制，transwell研究細(xì)胞分泌變化對細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果：0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)提高PIM-1蛋白表達(dá)以及Akt、p38和ERK蛋白磷酸化水平(P值均0.05)，加入Akt、p38和ERK蛋白抑制劑后，研究發(fā)現(xiàn)p38和ERK蛋白被抑制時PIM-1蛋白表達(dá)水平下降(P0.01)，通過siRNA抑制PIM-1基因發(fā)現(xiàn)漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后MSCs增殖率下降(P0.01)。Transwell結(jié)果顯示0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)顯著提高M(jìn)SCs遷移率(P0.05)，提示MSCs細(xì)胞分泌水平提高可能促進(jìn)了細(xì)胞遷移。0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)干預(yù)后，MSCs中纖連蛋白(FN)和玻璃粘連蛋白(VN)的表達(dá)增加(P0.05)，提示漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)可能通過增加這兩種粘附蛋白的表達(dá)促進(jìn)MSCs粘附能力提升。 第三部分漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)對衰老MSCs活性功能影響 取4周齡SD大鼠和24月齡SD大鼠MSCs，研究衰老對MSCs生長狀態(tài)以及耐受剪應(yīng)力的影響。給予抗氧化劑干預(yù)后，記錄細(xì)胞群體倍增數(shù)，檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）和蛋白質(zhì)金屬羰基合物（protein carbonyls）水平，并通過real time PCR檢測p16和p53基因表達(dá)。對不同組MSCs分別施加漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)，觀察細(xì)胞增殖、遷移、分泌、粘附和凋亡的情況。結(jié)果：與4周齡SD大鼠來源MSCs相比，24月齡SD大鼠來源MSCs群體倍增數(shù)（PD）明顯下降(P0.01)，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著升高(P0.05)，p16和p53基因表達(dá)增加(P0.05)。在使用抗氧化劑干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激強(qiáng)度下降(P0.05)，p16和p53基因表達(dá)水平下降(P0.05)，群體倍增數(shù)增加(P0.05)。24月齡SD大鼠來源MSCs在接受漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后，MSCs活性功能未明顯提高，凋亡增加(P0.05)；給予抗氧化劑干預(yù)后，漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)提高衰老MSCs活性功能及減少凋亡(P0.05)。 第四部分漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞分化及其機(jī)制研究 漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)誘導(dǎo)MSCs向平滑肌樣細(xì)胞方向分化，免疫熒光染色法觀察誘導(dǎo)分化后細(xì)胞是否表達(dá)平滑肌樣細(xì)胞特異性標(biāo)志物平滑肌肌動蛋白（SMA）和鈣調(diào)蛋白（Calponin），real time PCR分析SMA和Calponin基因表達(dá)，通過特異性蛋白抑制劑探索相關(guān)機(jī)制。結(jié)果：SMA和Calponin免疫熒光染色陽性，提示漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)誘導(dǎo)MSCs向平滑肌樣細(xì)胞方向分化。Real time PCR結(jié)果顯示漸進(jìn)性力學(xué)處理后SMA和Calponin基因表達(dá)顯著增加(P0.01)，漸進(jìn)性力和TGF-β1處理提高這兩種基因表達(dá)(P0.01)。PD98059（ERK阻斷劑）抑制MSCs向平滑肌樣細(xì)胞方向分化(P0.05)，提示ERK分子信號通路在調(diào)控細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。 第五部分漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)MSCs種植后在體研究 將漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后MSCs和未經(jīng)力學(xué)適應(yīng)MSCs分別種植于脫細(xì)胞豬主動脈壁上。采用仿生脈動生物反應(yīng)器模擬體內(nèi)力學(xué)環(huán)境處理血管后，分光光度法檢測DNA含量，western blot檢測I型膠原含量。將MSCs種植于脫細(xì)胞帶瓣管道上并移植于犬腹主動脈，1月后行B超觀察，并取組織標(biāo)本行大體觀察、HE染色、DNA和膠原含量測定。結(jié)果：在體外模擬實驗中，漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后的MSCs在主動脈壁上存留較多，DNA含量明顯高于對照組(P0.01)，Western blot結(jié)果顯示漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后MSCs的I型膠原含量明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P0.01)。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)兩種移植物均無血栓形成，力學(xué)適應(yīng)后MSCs在移植物上存留較多，DNA含量明顯高于對照組(P0.01)，分泌膠原含量也顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P0.01)。說明力學(xué)適應(yīng)后MSCs接種于支架材料后可較好耐受高速、高壓流體力的沖擊。 結(jié)論 1.本研究系統(tǒng)探索了恒定剪應(yīng)力和漸進(jìn)性增加剪應(yīng)力對培養(yǎng)MSCs的作用，發(fā)現(xiàn)隨著0、5、10和15dyn/cm2剪應(yīng)力強(qiáng)度逐漸增加， MSCs的增殖、遷移、分泌和粘附能力經(jīng)過力學(xué)訓(xùn)練后得到提高，0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)可以進(jìn)一步提高細(xì)胞增殖、遷移、分泌和粘附能力，同時0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)相比于同等強(qiáng)度下的高恒定剪應(yīng)力可以減少細(xì)胞凋亡。 2.研究證實0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)可激活p38和ERK信號通路調(diào)控的PIM-1蛋白表達(dá)從而促進(jìn)MSCs增殖，提高了MSCs的自分泌能力使其遷移能力增強(qiáng)，并且促進(jìn)FN和VN蛋白表達(dá)使MSCs粘附能力提高，初步闡明了漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)提高M(jìn)SCs活性功能的機(jī)制。 3.研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠來源MSCs比青年大鼠來源MSCs氧化應(yīng)激水平升高、DNA和蛋白質(zhì)損傷加重以及活性功能下降。在接受0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后，老年大鼠來源MSCs活性功能未見顯著提高，凋亡率也明顯上升。給予抗氧化劑干預(yù)后，0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)提高老年大鼠來源MSCs活性功能并減少凋亡。 4.0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)可以在體外培養(yǎng)時誘導(dǎo)MSCs向平滑肌樣細(xì)胞方向分化，這種誘導(dǎo)能力在結(jié)合TGF-β1后得到進(jìn)一步增強(qiáng)，ERK信號通路可能參與調(diào)控了誘導(dǎo)分化過程。 5.經(jīng)過體內(nèi)和體外模擬機(jī)體周期搏動性血流研究后發(fā)現(xiàn)，0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后的MSCs可以更好的附著和存活于支架材料上，能夠分泌膠原蛋白，在此基礎(chǔ)上可以更好的發(fā)揮組織重塑功能。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文加，可避免瓣葉中央下陷，維持瓣葉間的接合，起到防止瓣葉脫垂的作用。心室層的彈力蛋白徑向分布，極富延展性，硬度較膠原蛋白低[30]。在收縮期，彈力蛋白回縮使膠原纖維狀態(tài)恢復(fù)到褶皺、蜷曲，瓣葉變小，瓣膜開放[20]。瓣膜受反向力作用而關(guān)閉，其所需的反向作用張力是極其微小的，而隨著瓣膜的逐步伸展，其自身硬度直線增加，瓣膜所承受的張力和應(yīng)變強(qiáng)度亦增加到非常高的水平。這就是瓣膜組織能夠靈活適應(yīng)血流變化且能承受左心系統(tǒng)高血流動力的原因（圖 1）。

圖 2. 組織工程心血管移植物構(gòu)建模式圖尋找到可靠的細(xì)胞來源是組織再生的關(guān)鍵[54]。多種不同表型的細(xì)胞可以程醫(yī)學(xué)，但是每種細(xì)胞都有自己的優(yōu)勢和缺陷[55]。其中從患者自身采集是最具希望的一種，因為自體細(xì)胞移植入體內(nèi)后不會引起免疫排斥反應(yīng)。處于疾病狀態(tài)下的老年患者，自體細(xì)胞并不適宜用作自體移植[55]。目前
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.11

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2566039