發(fā)布時間：2019-10-30 16:20

【摘要】：[研究背景與目的]骨缺損是臨床上常見的癥狀,包括先天性和后天性。骨缺損的修復(fù)主要包括自體、異體骨移植和人工材料充填三種方法,但均有其自身無法克服的局限性。二十世紀(jì)八十年代,組織工程概念的提出為解決這-難題提供了新的思路和方法。由于骨缺損在臨床上的常見性和治療上的迫切性,使得骨修復(fù)成為目前組織工程研究中發(fā)展最快的領(lǐng)域。采用組織工程技術(shù)有望避免自體骨移植的缺點,利用自體具有成骨活性的種子細(xì)胞和可降解材料復(fù)合回植體內(nèi),并使用相關(guān)的細(xì)胞因子促進成骨,隨著材料的逐步降解,植入的成骨活性細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì),最終形成組織工程骨修復(fù)缺損,同時避免了自體骨供區(qū)的繼發(fā)性損傷。組織工程骨的三大重要因素為種子細(xì)胞、支架材料和生長因子。脂肪來源干細(xì)胞因其分布廣泛、來源充足、易于獲取等優(yōu)點成為組織工程種子細(xì)胞的優(yōu)先選擇之-。β-磷酸三鈣的主要成分與入骨的無機成分相似,是比較理想的骨組織工程人工支架材料。富血小板血漿制備簡單,并含有高濃度的生長因子,是目前自體生長因子的主要來源,其含有的多種因子在促骨組織修復(fù)、加快新骨形成中具有極為重要的作用。親和素-生物素橋接系統(tǒng)是近幾年發(fā)展很迅速的-門生物學(xué)技術(shù),兩者之間的共價鍵是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定的共價鍵,可以促進細(xì)胞在支架上早期粘附,有利于細(xì)胞的增殖。本實驗在對脂肪來源干細(xì)胞和β-磷酸三鈣的研究基礎(chǔ)上,采用脂肪來源干、細(xì)胞和生物素-親和素系統(tǒng)修飾的β-TCP支架復(fù)合富血小板血漿在動物體內(nèi)異.位及原位分別構(gòu)建組織工程骨,并研究富血小板血漿對促進成骨的作用。[材料與方法](一)脂肪來源干細(xì)胞分離、鑒定、培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化(1)自新西蘭大白兔的腹股溝切取脂肪組織,經(jīng)常規(guī)酶消化法提取脂肪來源干細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)；(2) 采用單克隆抗體標(biāo)記ADSCs,然后采用細(xì)胞免疫組化測定干細(xì)胞表面標(biāo)志物：CD29.CD34.CD44.CD105等;(3) 通過誘導(dǎo)分化劑的誘導(dǎo),將ADSCs誘導(dǎo)分化成脂、成骨,通過油紅0染色、堿性磷酸酶染色和Von Kossa染色了解干細(xì)胞成脂、成骨情況。(二)β-磷酸三鈣支架的制備及特性鑒定(1)以硝酸鈣和磷酸氫二銨溶液為原料,液相沉淀法制備納米級β-TCP粉體,以氯化銨為造孔劑,程序升溫法燒結(jié)成納米級多孔β-TCP支架材料；(2)對材料的物相進行X線衍射、傅里葉紅外線轉(zhuǎn)換光譜分析儀測試,萬能試驗機測定材料的抗壓強度,液體靜力稱量法測定材料的孔隙率和吸水率；(3)對材料的微觀結(jié)構(gòu)進行掃描電子顯微鏡觀察。(三)生物素-親和素系統(tǒng)促進脂肪來源干細(xì)胞在β-磷酸三鈣支架上粘附的研究(1)用CCK-8法檢測多孔β-TCP支架提浸液毒性；(2)利用免疫熒光以及流式細(xì)胞儀檢測ADSCs生物素化的效率；(3)采用CCK-8法檢測ADSCs與多孔β-TCP支架、生物素-親和素系統(tǒng)修飾ADSCs與多孔β-TCP支架的粘附效率；(4)采用掃描電鏡檢測ADSCs與多孔β-TCP支架、生物素-親和素系統(tǒng)修飾ADSCs與多孔β-TCP支架材料的表面情況。(四)富血小板血漿促進脂肪來源干細(xì)胞與9-磷酸三鈣支架裸鼠體內(nèi)異位成骨的研究(1)兩次離心法制備富血小板血漿；(2)實驗分為四組：β-TCP組、β-TCP+PRP組、ADSCs+β-TCP組及ADSCs+β-TCP+PRP組,在裸鼠背部皮下異位成骨；(3)8周后取出標(biāo)本行蘇木精伊紅(HE)染色及骨鈣素(OCN)染色,進行組織學(xué)觀察。(五)富血小板血漿促進脂肪來源干細(xì)胞與β-磷酸三鈣支架修復(fù)兔下頜骨缺損的研究(1) 本實驗采用新西蘭大白兔,共6只分為兩組,包括A組(對照組)：ADSCs+β-TCP組；B組(實驗組)：ADSCs+β-TCP+PRP組。在兔下頜骨體制作骨性缺損,用材料復(fù)合物進行修復(fù)；(2)在實驗第4周時處死兔,并行頭顱CT平掃,觀察支架與周圍骨的融合情況；(3)4周后取出標(biāo)本行蘇木精伊紅(HE)染色及骨鈣素(OCN)染色,進行組織學(xué)觀察：(4)熒光定量RT-PCR測骨鈣素(OCN),堿性磷酸酶(ALP)的表達量。1.自新西蘭大白兔腹股溝切取脂肪,經(jīng)常規(guī)酶消化法分離培養(yǎng)的細(xì)胞,具有干細(xì)胞的形態(tài)和特性,經(jīng)細(xì)胞免疫組化檢測其表面標(biāo)志物的表達為CD29,CD44,CD105呈陽性表達,而CD34表達呈陰性表達；經(jīng)定向誘導(dǎo)分化,發(fā)現(xiàn)ADSCs具有成脂、成骨多向分化的潛能。2.支架材料成分為β-TCP,晶粒尺寸31.5nm,孔隙率71.26±0.28VoI%(n=5),吸水率38.51±0.21Wt%(n=5),抗壓強度7.93±0.06MPa(n=5),孔隙均勻豐富,連通性好。3.ADSCs與多孔8-TCP支架提浸液濃度100%、50%、10%、1%的相對增長率分別為107.48±10.32%、105.63±9.85%、108.51±12.06%、109.04±8.17%。生物素化的ADSCs熒光染色顯示生物素結(jié)合部位在細(xì)胞胞質(zhì),且流式細(xì)胞儀檢測提示生物素化細(xì)胞陽性率為95%。不同時間點(10分鐘、30分鐘、60分鐘、12小時、24小時)ADSCs與多孔 β-TCP支架、生物素-親和素系統(tǒng)修飾ADSCs與多孔β-TCP支架材料的粘附率分別為2.31±0.14%vs21.75±4.69%,11.96±2.53%vs54.82±12.37%,33.48±9.51%vs78.69±15.65%,78.29±10.63%vs95.46±7.38%,94.79±10.42%vs98.13±1.45%。4.裸鼠體內(nèi)構(gòu)建異位組織工程骨的A組(β-TCP組)與B組(β-TCP+PRP組)的蘇木精伊紅(HE)染色及骨鈣素(OCN)染色僅有極少量細(xì)胞及成骨細(xì)胞外基質(zhì)著色。但是C組(ADSCs+β-TCP組)與D組(ADSCs+β-TCP+PRP組)的的HE染色及OCN染色可見大量細(xì)胞及成骨細(xì)胞外基質(zhì)著色,且D組比C組更為明顯。5.兔下頜骨缺損修復(fù)實驗中頭顱CT三維成像顯示支架與周圍骨的融合較好。蘇木精伊紅(HE)染色及骨鈣素(OCN)染色顯示更多細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)著色,實驗組比對照組更為明顯。6.兔下頜骨缺損修復(fù)實驗中對A組(ADSCs+β-TCP組)與B組(ADSCs+β-TCP+PRP組)上ADSCs的cDNA進行PCR擴增反應(yīng),檢測兩個樣本骨鈣素(OCN),堿性磷酸酶(ALP)的mRNA表達水平。A組的OCN表達值為17.49±3.52,B組的OCN表達值為26.38±7.17；A組的ALP表達值為15.12±4.21,B組的ALP表達值為49.62±8.34。B組均優(yōu)于A組。1.脂肪來源干細(xì)胞分離培養(yǎng)簡單,獲取容易,干性強,傳代穩(wěn)定,具有多向分化的潛能。2.實驗制備的納米級β-TCP粉體反應(yīng)完全,無雜質(zhì),晶粒細(xì)膩,燒結(jié)出的納米級多孔β-TCP支架材料具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和孔隙連通性,并具備一定的抗壓強度,可以作為支架材料為進一步的實驗所使用。3.多孔β-TCP支架提浸液對ADSCs并無細(xì)胞毒性作用,細(xì)胞與支架生物相容性好。生物素-親和素系統(tǒng)修飾的ADSCs和β-TCP支架可以促進ADSCs在支架上早.期粘附。4.在裸鼠皮下異位成骨實驗及兔下頜骨缺損修復(fù)實驗中,ADSCs+β-TCP+PRP組合可構(gòu)建組織工程骨。5.在裸鼠皮下異位成骨實驗及兔下頜骨缺損修復(fù)實驗中PRP能起到加速成骨的作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊志明,趙雍凡,解慧琪,黃富國,劉欣,李濤;組織工程肋骨移植修復(fù)胸壁巨大缺損[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2000年06期

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本文編號：2553865