【摘要】：骨作為人體最重要的組織器官,在生命活動(dòng)中承擔(dān)著不可替代的作用,但是骨缺損卻是臨床上的常見病多發(fā)病。目前骨缺損修復(fù)方法主要有自體骨移植、同種異體骨移植,異種骨移植、及假體、金屬、高分子材料等人工骨替代材料等。但這些手段也都存在各自的缺陷,比如來(lái)源有限、創(chuàng)傷性大、排異反應(yīng),生物相容性不足、金屬腐蝕性和機(jī)械性能差等等。超臨界顱骨缺損受自身修復(fù)能力所限制,需要外界干預(yù)和相應(yīng)的植入材料才能達(dá)到愈合的目的,如顱骨缺損。所以修補(bǔ)巨大和復(fù)雜的骨缺損仍是骨重建中的具有挑戰(zhàn)性的問題,目前沒有明確有效的治療方法。因此,研究和開發(fā)能有效促進(jìn)骨缺損修復(fù)的生物相容性和骨誘導(dǎo)性良好的生物材料和方法對(duì)臨床具有非常重要的意義。組織工程是一門快速發(fā)展起來(lái)的多學(xué)科交叉再生科學(xué),對(duì)于修復(fù)病理或損傷組織具有廣闊的前景。目前已有眾多研究方法進(jìn)行損傷修復(fù),比如軟骨、各類硬骨骼、血管等的修復(fù)。組織工程的核心就是將細(xì)胞與生物材料相結(jié)合,建立三維空間復(fù)合體,模擬替代病變或受損組織,進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建以達(dá)到對(duì)缺損和創(chuàng)傷修復(fù)的功能。三維支架和種子細(xì)胞共培養(yǎng)是組織工程中最典型的培養(yǎng)方式。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)由于其可獲得性、可擴(kuò)增性和可多向分化性,成為非常理想的組織工程種子細(xì)胞來(lái)用于構(gòu)建工程組織。作為一種誘導(dǎo)性骨祖細(xì)胞,BMSCs在骨形態(tài)發(fā)生蛋白等誘導(dǎo)物質(zhì)作用下會(huì)向成骨細(xì)胞分化,在體外甚至沒有成骨誘導(dǎo)劑的作用下,BMSCs在磷酸鈣相關(guān)材料上也會(huì)向成骨細(xì)胞分化。近年來(lái),以BMSCs作為種子細(xì)胞在骨缺損修復(fù)的基礎(chǔ)和臨床研究中取得了良好的效果。除了種子細(xì)胞,在組織工程骨培養(yǎng)方式中,作為最重要因素的支架材料,不僅為種子細(xì)胞提供三維的結(jié)構(gòu)支架,使細(xì)胞在立體的環(huán)境中增殖填充,更模擬了與體內(nèi)組織相似的細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境,為細(xì)胞提供了特異性的生長(zhǎng)和分化信號(hào)最后引導(dǎo)特異組織形成。一般來(lái)說(shuō)三維支架應(yīng)該具有合適的生物相容性,合適的降解時(shí)間和生物降解率和適當(dāng)?shù)亩嗫孜⒔Y(jié)構(gòu)等基本性能。為了滿足組織或支架內(nèi)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能運(yùn)送到細(xì)胞,廢物及時(shí)排出以及血管的形成和組織增長(zhǎng),支架還要求具有開放的、相互連通的大孔結(jié)構(gòu)。因此在生物材料領(lǐng)域,設(shè)計(jì)孔隙率、孔徑和凝膠表面化學(xué)可控制的超大孔徑的高分子材料具有非常重要的意義。水凝膠類支架由于類細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)仿生特性,高度的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),有利于細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng),適用于作為細(xì)胞支架或各種因子緩釋的載體。為了滿足生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用,水凝膠被設(shè)計(jì)成類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),可以為細(xì)胞提供三維(3D)支架環(huán)境,支持細(xì)胞增長(zhǎng)和組織的形成�；谔烊坏纳锞酆衔锖铣傻乃z比人工合成材料制備的水凝膠有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)。近些年來(lái),冷凍復(fù)溫成膠,成為一類很有前景的用于制備組織工程支架材料的方法,叫做冷凍成膠(cryogelation),制備出的水凝膠叫做冷凍凝膠(cryogel)。利用冷凍成膠可以制備多種形態(tài)、生物相容性好的大孔徑材料,并且具有開放和高滲透的多孔結(jié)構(gòu),組織彈性,和一定的機(jī)械強(qiáng)度,很適合溶液的擴(kuò)散以及細(xì)胞、微生物、大分子物質(zhì)等的轉(zhuǎn)運(yùn)。組織工程骨除了結(jié)構(gòu)上模擬天然骨之外,在成分組成上也要盡量相似。明膠是非常便宜,來(lái)源廣泛的具有很多功能基團(tuán)的變性膠原蛋。與膠原相比,明膠具有更好的水溶性和低抗原性。明膠溶液本身也有獨(dú)特的性能,在低溫下會(huì)形成物理交聯(lián)的水凝膠。此外,多種交聯(lián)劑可以用來(lái)與明膠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)共價(jià)交聯(lián)明膠。明膠丙烯酸甲酯(GelMA)水凝膠由于其良好的生物屬性和可調(diào)的物理特性被廣泛用于各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中。GelMA水凝膠與天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)有一些相似的基本性質(zhì),比如存在與細(xì)胞黏附以及基質(zhì)金屬蛋白酶反應(yīng)的氨基酸結(jié)構(gòu)單元,可以允許細(xì)胞在GelMA支架上黏附伸展及增殖。GelMA可以與納米粒子如碳納米管、石墨烯氧化物、羥基磷灰石等無(wú)機(jī)材料以及其他聚合物復(fù)合制成化學(xué)性質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等特殊需求的生物支架網(wǎng)絡(luò)。最近的研究證明了以GelMA為基礎(chǔ)的水凝膠在組織工程領(lǐng)域被廣泛的應(yīng)用,包括骨、軟骨、心臟和血管組織工程等。除此之外,GelMA在基礎(chǔ)細(xì)胞研究、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、藥物和基因傳遞等方面也用處廣泛。骨組織由無(wú)機(jī)礦物質(zhì)和有機(jī)蛋白質(zhì)組成,羥基磷灰石(Hydroxyapatite, HAP)是骨的主要無(wú)機(jī)成分,人工合成羥基磷灰石因其良好的生物相容性、較強(qiáng)的骨傳導(dǎo)性、誘導(dǎo)性、較高的化學(xué)穩(wěn)定性以及與天然骨礦物質(zhì)類似的生物學(xué)效應(yīng)被廣泛用作人工骨替代物或骨缺損植入材料或涂層。但是單純羥基磷灰石存在脆性大、塑型難等缺陷,在組織工程應(yīng)用中通常將其與高分子有機(jī)物復(fù)合制備支架材料。除此之外,羥磷灰石顆粒大小、形狀、表面化學(xué)性質(zhì)和其他很多因素都會(huì)影響羥磷灰石與細(xì)胞之間的相互作用,選擇合適的羥基磷灰石也很重要。無(wú)機(jī)的羥基磷灰石與有機(jī)的高分子材料復(fù)合不僅可以模擬天然骨的成分組成,還可以大大增加支架材料的機(jī)械性能。將羥基磷灰石復(fù)合到冷凍凝膠中與單純水凝膠材料優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),揚(yáng)長(zhǎng)避短,有望得到性能更好的生物材料。本研究的目的是開發(fā)可生物降解的具有互相貫通大孔隙基于羥基磷灰石和明膠丙烯酸甲酯(GelMA)復(fù)合材料的冷凍水凝膠,作為骨組織再生的支架。首先合成明膠丙烯酸甲酯(GelMA),然后以明膠丙烯酸甲酯(GelMA)為基礎(chǔ),通過添加不同濃度的微米級(jí)羥磷灰石通過冷凍成膠來(lái)制備性能不同的cryogel,并對(duì)合成的水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶脹比、孔隙形態(tài)、機(jī)械性能等進(jìn)行表征。并進(jìn)一步體外通過檢測(cè)原代培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在合成的含不同濃度羥基磷灰石水凝膠上的生存能力和細(xì)胞分化情況來(lái)驗(yàn)證了水凝膠的生物相容性和成骨誘導(dǎo)性能,通過體內(nèi)對(duì)大鼠顱骨缺損的修復(fù)效果驗(yàn)證為將來(lái)的組織工程的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。第1章大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及鑒定目的：分離大鼠下肢骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),并對(duì)所分離的BMSCs細(xì)胞進(jìn)行鑒定,確定干細(xì)胞純度和其成骨分化性能。方法：4周齡雄性Sprague Dawley (SD)大鼠,2只,利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法,分離提取大鼠下肢骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),并對(duì)所分離的BMSCs細(xì)胞進(jìn)行傳代純化和擴(kuò)增培養(yǎng)。(1)顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察；(2)傳代培養(yǎng)至第4代時(shí),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所取得的細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記物鑒定,包括CD44、CD45、CD34、CD90; (3) BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),進(jìn)行ALP及茜素紅染色鑒定其分化性能。結(jié)果：(1)顯微鏡下觀察,初始時(shí)BMSCs細(xì)胞呈梭形、紡錘形和多角形,后呈克隆樣生長(zhǎng),以梭形細(xì)胞為主,胞核卵圓形,融合的細(xì)胞呈漩渦狀排列。(2) BMSCs的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：征性表面抗體陽(yáng)性率為CD44(87.78%),CD90(98.14%)；非特征性抗體的陽(yáng)性率：CD34 (0.14%), CD45 (0.06%). (3) ALP染色結(jié)果示：成骨誘導(dǎo)后的BMSCs染成藍(lán)紫色,結(jié)果陽(yáng)性。(4)誘導(dǎo)四周茜素紅染色結(jié)果陽(yáng)性,有礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生。結(jié)論：(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs來(lái)源豐富、取材簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng),無(wú)倫理學(xué)限制,本實(shí)驗(yàn)成功提取大鼠BMSCs; (2)所分離的BMSCs形態(tài)及表型符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征；(3)所分離的BMSCs純度較高,可應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)體外及后續(xù)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究；(4)所分離的BMSCs在一定條件下具有良好的成骨分化性能。第2章微米羥基磷灰石生物特性及體外成骨效果檢測(cè)目的：本實(shí)驗(yàn)選取了微米級(jí)羥基磷灰石,對(duì)其形貌進(jìn)行了表征,并與前成骨細(xì)胞系共培養(yǎng),體外探索其與細(xì)胞的生物相容性及體外成骨誘導(dǎo)特性。方法：本實(shí)驗(yàn)以選取了微米羥基磷灰石,首先分別通過掃描電鏡和馬爾文Zeta電位儀觀測(cè)其形貌及檢測(cè)表面電荷,進(jìn)一步檢測(cè)此mHAP體外與細(xì)胞的生物相容性及成骨誘導(dǎo)特性：(1)不同濃度的rnHAP (Oug ml-1、250ug ml-1、 500ug ml-1、1000ug ml-1)與前成骨細(xì)胞系(MC3T3-E1)細(xì)胞共培養(yǎng),CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；(2)選取了最優(yōu)mHAP濃度與MC3T3-E1共培養(yǎng),活死染色方法驗(yàn)證其生物相容性；(3)標(biāo)記了FITC熒光基團(tuán)的mHAP用來(lái)觀察mHAP與細(xì)胞共培養(yǎng)的過程中的黏附作用；(4)分別用堿性磷酸酶定性染色和定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP的表達(dá)情況。結(jié)果：(1)電鏡下可以看到此羥基磷灰石粉末形狀為微球體,表面光滑；粒徑不均,約5-200微米之間,大直徑的微球破壞后暴露出內(nèi)部包裹著的小直徑的微球；(2) FITC熒光標(biāo)記的mHAP會(huì)黏附在細(xì)胞上面,與細(xì)胞之間有相互作用;(3) mHAP表面電荷為-39.84±1.37 mV(n=8)；(4)不同濃度mHAP (Oug ml-1、250ugml-1、500ugml-1、1000ug ml-1)與MC3T3-E1細(xì)胞共培養(yǎng)24h后,與Oug ml-1對(duì)照組相比,其他各組均促進(jìn)細(xì)胞增殖(P0.01),其中500ugml-1促進(jìn)作用最顯著,濃度增大到1000ug ml-1促進(jìn)作用有所減小；(5)活死染色結(jié)果顯示,mHAP與細(xì)胞間有良好的生物相容性和黏附性；(6)堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示,不管有沒有成骨誘導(dǎo)液存在,500ug ml-1濃度mHAP與細(xì)胞共培養(yǎng)能促進(jìn)ALP表達(dá)分泌。結(jié)論：(1)本實(shí)驗(yàn)選擇的羥基磷灰石為光滑的球形,直徑大多接近100um,帶負(fù)電荷；(2)低濃度mHAP (500ug/ml)微球具有良好的生物相容性,能促進(jìn)前成骨細(xì)胞的黏附與增殖；(3)低濃度mHAP微球能促進(jìn)前成骨細(xì)胞ALP分泌,有良好的成骨誘導(dǎo)性。第3章微米羥基磷灰-明膠丙烯酸甲酯冷凍水凝膠的制備表征及體外生物特性檢測(cè)目的：以明膠(Gel)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)為原料制備了明膠-甲基丙烯酸甲酯接枝共聚物(GelMA),然后擬將無(wú)機(jī)的微米級(jí)羥基磷灰石(mHAP)與GelMA相復(fù)合,不僅可以模擬天然骨的成分組成,還可以增加支架材料的機(jī)械性能；通過冷凍成膠的方法,和添加不同質(zhì)量／體積分?jǐn)?shù)的mHAP制備性能不同的cryogel,并對(duì)材料進(jìn)行表征,體外驗(yàn)證材料的生物相容性、成骨特性,為骨組織修復(fù)提供依據(jù)。方法：(1)以明膠(Gel)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)為原料制備明膠-甲基丙烯酸甲酯接枝共聚物(GelMA);(2)以3.33%濃度的GelMA為基礎(chǔ),復(fù)合質(zhì)量／體積分?jǐn)?shù)分別為0%、1%、2.5%、5%、10% mHAP,加入過硫酸銨(AP)和四甲基二乙胺(TEMED)作為交聯(lián)和催化劑,并通過冷凍成膠的方法制備含不同濃度mHAP的cryogel;(3)對(duì)含不同濃度mHAP的cryogel的溶脹性能進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比；(4)對(duì)不同溫度下制備的含不同濃度mHAP的cryogel利用bose機(jī)檢測(cè)材料的彈性模量,反應(yīng)其機(jī)械強(qiáng)度；(5)在材料上種植BMSCs細(xì)胞,用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞的黏附情況；(6)選擇0%、2.5%、10% mHAP的cryogel以及單純羥基磷灰石利用傅里葉紅外光譜確定材料成分；(7)對(duì)0%、2.5%、10% mHAP的cryogel通過掃面電鏡對(duì)其形貌進(jìn)行了表征；(8) BMSCs種植在不同質(zhì)量／體積分?jǐn)?shù)mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel上分別1天,3天,5天,利用活死染色試劑盒對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)通過掃描電鏡對(duì)3周時(shí)材料上細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)進(jìn)行了觀察；(9) BMSCs種植于含不同質(zhì)量／體積分?jǐn)?shù)mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel上后,分別培養(yǎng)3天,1周,2周之后提取RNA,實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)成骨相關(guān)基因RUNX2、OCN和IBSP的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)；(10)與上步驟同樣的樣本,培養(yǎng)到3周之后利用免疫熒光方法對(duì)成骨相關(guān)蛋白OCN的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：(1)以3.33%濃度的GelMA為基礎(chǔ),復(fù)合質(zhì)量／體積分?jǐn)?shù)分別為0%、1%、2.5%、5%、10% mHAP,加入過硫酸銨(AP)和四甲基二乙胺(TEMED)通過冷凍成膠的方法,均可順利成膠,彈性良好；不含mHAP的cryogel呈透明狀,含mHAP的cryogel隨著mHAP含量的增多膠體越來(lái)越呈現(xiàn)白色；(2)溶脹率檢測(cè)：不含mHAP的cryogel在前5min內(nèi)具有最快的吸水速率和最大的平衡溶漲比(Qc=15.38),與其相比,復(fù)合了mHAP的cryogel吸水速率和平衡溶漲比都會(huì)減小,說(shuō)明吸水能力減小,且復(fù)合的mHAP比例越多(分別為1%、2.5%、5%、10%的mHAP),平衡溶漲比數(shù)值越小(分別為9.05、8.67、5.89、5.64)；其中濃度1%和2.5%的平衡溶漲比數(shù)值接近,濃度5%、和10%的平衡溶漲比數(shù)值接近；(3)不同溫度下制備的0%、2.5%、10%三個(gè)濃度的cryogel機(jī)械性能：不管是在-20℃還是在-80℃下制備的cryogel,不添加mHAP的cryogel彈性模量最低(分別是36.02±3.67kPa和7.32±1.09kPa),添加了2.5%質(zhì)量／體積mHAP的cryogel彈性模量有所升高(分別為53.47±8.43和43.72±7.64),而添加到10%質(zhì)量／體積mHAP的cryogel彈性模量最高(分別增加到了70.14±10.07和54.7±12.2)與不添加mHAP組比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。不同溫度下制備的同一濃度cryogel相比,-20℃成膠均比-80℃的膠彈性模量大；其中不含mHAP的cryogel -20℃與-80℃相差最大(P0.001)：(4)同一溫度下制備的不同mHAP濃度的cryogel,不含mHAP的cryogel黏附率高于含2.5% mHAP的cryogel (P0.01)和含10% mHAP的cryogel (P0.01)。而同一mHAP濃度不同溫度下制備的cryogel的細(xì)胞黏附率差別不大；(5)傅立葉紅外光譜檢測(cè)顯示,含mHAP質(zhì)量／體積分?jǐn)?shù)為2.5%、10%的cryogel同時(shí)具備單純GelMA和單純HAP的特有吸收峰,只是峰值較小,說(shuō)明兩種材料成功復(fù)合在一起；(6)不同質(zhì)量／體積分?jǐn)?shù)mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel的掃描電鏡圖片顯示了其形貌,每組支架材料均呈現(xiàn)相互貫通的蜂窩狀大孔結(jié)構(gòu),不含mHAP單純GelMA制備的cryogl孔徑大約在20-200um左右,表面光滑通透；加入2.5% mHAP孔徑變化不大,mHAP顆粒包裹在膠體支架壁內(nèi),壁表面也由于加入mHAP而變的粗糙不平；當(dāng)加入mHAP增加到10%時(shí),可觀察到孔徑有所減小,且干燥后有坍塌的趨勢(shì),表面更加粗糙不平,可見大量塊狀突起,支架側(cè)壁明顯增厚；(7) BMSCs在含不同質(zhì)量／體積分?jǐn)?shù)mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel上的細(xì)胞活死染色結(jié)果顯示,各組材料上細(xì)胞均活力良好,少見紅色死細(xì)胞。第1天時(shí),三組材料上的細(xì)胞均沒有鋪展開,細(xì)胞形態(tài)較圓,其中0% mHAP組和2.5%mHAP組黏附細(xì)胞都比較多,10% mHAP組黏附細(xì)胞相對(duì)較少；第3天時(shí),各組材料上細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化,細(xì)胞由圓形變成了伸展開的長(zhǎng)梭形,10% mHAP組細(xì)胞依然最少；第5天時(shí),各組細(xì)胞均增殖明顯,BMSCs生長(zhǎng)成克隆樣,10% mHAP組最少；(8)BMSCs在含不同質(zhì)量／體積分?jǐn)?shù)mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel上的細(xì)胞形態(tài)掃描電鏡結(jié)果：總體來(lái)說(shuō)各組均有大量細(xì)胞生長(zhǎng),細(xì)胞基本呈長(zhǎng)梭形,其中0%、2.5%組細(xì)胞鋪滿整個(gè)cryogel表面和孔隙內(nèi)壁的表面,10%組細(xì)胞生長(zhǎng)相比于其他兩組較少,可觀察到圓形細(xì)胞；(9) BMSCs種植于含不同質(zhì)量／體積分?jǐn)?shù)mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel上后,不同時(shí)間點(diǎn)3天,1周,2周后成骨相關(guān)基因表達(dá)：3天的時(shí)候,RUNX2、OCN和IBSP在各組材料上的表達(dá)都較低,但是1周和2周之后,與0%組相比,2.5%組和10%組各基因表達(dá)都有大幅度升高,其中RUNX2基因在2.5%組材料表達(dá)最高,OCN和IBSP在10%組材料上表達(dá)最高。具體如下：對(duì)于RUNX2基因,3天時(shí),0%2.5%10%***/##,1周的時(shí)候,2.5%和10%組RUNX2表達(dá)均上升,2.5%***10%***/##0%,2周時(shí)2.5%***10%***0%；對(duì)于OCN,3天時(shí)三組相差不大,1周時(shí)10%**/#2.5%**0%,2周時(shí),2.5%和10%組OCN表達(dá)繼續(xù)升高,10%****/##2.5%****0%；對(duì)于IBSP基因,3天時(shí)10%組表達(dá)高于其他兩組(P0.01),0%組和2.5%組沒差別,1周和三周時(shí)2.5%和10%組IBSP表達(dá)均不斷升高10%***2.5%***0%,其中2.5%和10%組差別不顯著；(*代表和0%組比較,#代表和2.5%組比較)；(10) BMSCs種植在不同cryogel上3周成骨相關(guān)蛋白OCN表達(dá)結(jié)果顯示,含0%和2.5% mHAP的cryogel細(xì)胞量都較多,含10% mHAP的cryogel細(xì)胞量相對(duì)較少但是成骨相關(guān)蛋白OCN的表達(dá)量確是最多,2.5%組次之,。說(shuō)明添加了羥基磷灰石有促進(jìn)成骨分化的功能,不含mHAP組OCN表達(dá)最少。結(jié)論：(1)以GelMA為基礎(chǔ),添加不同質(zhì)量／體積分?jǐn)?shù)的mHAP(0%、1%、2.5%、5%、10%),利用冷凍成膠的方法,成功制備出性能不同的有機(jī)無(wú)機(jī)材料復(fù)合的大孔隙率cryogel; (2)含不同濃度mHAP的cryogel溶脹率不同,添加mHAP會(huì)減小膠體的溶脹率,減小的程度與添加的量有關(guān)系；(3)含不同濃度mHAP的cryogel機(jī)械性能不同,添加mHAP可以增加膠體的彈性模量,且會(huì)溫度對(duì)膠體力學(xué)性能的影響；(4) mHAP在膠體中分散均勻,隨著GelMA中添加mHAP增多,膠體表面會(huì)由光滑變得粗糙,支架壁變厚,孔徑減小,膠體偏向致密；(5)添加2.5%和10% mHAP的cryogel與單純GelMA cryogel相比,會(huì)抑制細(xì)胞黏附增殖,但是相反的會(huì)促進(jìn)細(xì)胞成骨分化,隨著mHAP濃度越大抑制作用越明顯,但是促分化作用也越明顯,能明顯促進(jìn)成骨相關(guān)基因和蛋白R(shí)UNX2、OCN以及IBSP表達(dá)。第4章不同濃度微米羥基磷灰-明膠丙烯酸甲酯冷凍水凝膠修復(fù)大鼠顱骨缺損目的：本實(shí)驗(yàn)將不同濃度微米羥基磷灰-明膠丙烯酸甲酯冷凍水凝膠支架應(yīng)用于修復(fù)大鼠顱骨缺損,明確其在大鼠體內(nèi)的成骨效果。方法：(1)按第三部所示的方法制備不同濃度微米羥基磷灰-明膠丙烯酸甲酯冷凍水凝膠支架；(2)將以上3D支架種植于大鼠顱骨缺損部位,術(shù)后12周取材,進(jìn)行大體標(biāo)本的觀察；(3)應(yīng)用micro-CT方法對(duì)以上所有取得的樣本進(jìn)行掃描,明確所有樣品再生骨組織的新生骨面積,對(duì)樣品進(jìn)行三維重建明確骨修復(fù)的情況。結(jié)果：(1)各組樣品大體結(jié)果示：各組的顱骨缺損樣品表面平整,已無(wú)缺損殘留。(2) micro-CT檢查結(jié)果示mHAP濃度為0%、2.5%、10%的GelMAcryogel均對(duì)顱骨缺損有一定的修復(fù)效果,其中以2.5% mHAP的GelMA cryogel修復(fù)面積最大效果最好(17.272~0.807mm2.***), 10% mHAP GelMA cryogel效果次之(13.036±0.948mm2**),單純GelMA cryogel修復(fù)效果最差(10.658±1.910 mm2),證明含2.5% mHAP的cryogel具有最好的顱骨缺損修復(fù)能力。(*表示與模型組相比)結(jié)論：(1)成功造成大鼠顱骨臨界骨缺損模型,空白模型組經(jīng)十二周后不能自行進(jìn)行骨修復(fù),修復(fù)性能差；(2)三組含不同濃度mHAP(分別為2.5%、0%、10%)的cryogel均有不同程度的顱骨缺損修復(fù)功能,其中以2.5% mHAP水凝膠組修復(fù)面積最大,效果最好。
【圖文】：

后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加貼壁細(xì)胞逐漸增多呈克隆樣生長(zhǎng)，并多角形細(xì)逡逑胞為主，胞核卵圓形，培養(yǎng)到２周左右８０％－９０％融合率，融合的細(xì)跑呈游鍋狀逡逑排列。細(xì)胞傳代后生長(zhǎng)迅速，大多數(shù)呈長(zhǎng)梭形，一般２－３天能達(dá)到８０％的融合逡逑率。形態(tài)見圖１－１。逡逑

３．２邐ＢＭＳＣｓ流式細(xì)胞術(shù)干細(xì)胞特性檢n,逡逑待ＢＭＳＣｓ細(xì)胞傳代純化到第四代的時(shí)候，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)所培養(yǎng)的逡逑細(xì)胞的純度，即細(xì)胞所攜帶干細(xì)胞表面標(biāo)記物的陽(yáng)性率。結(jié)果如下圖１－２：其逡逑中ＢＭＳＣｓ特征性表面抗體陽(yáng)性率為ＣＤ４４邋（８７．７８％），ＣＤ９０邋（９８．１４％），非特征逡逑性抗體的陽(yáng)性率為ＣＤ３４（０．１４％），ＣＤ４５（０．０６％）。逡逑１邋—邋１邋３４邋■邋ｔ；…＂。１邐，邋Ｍ逡逑W＂｜邋■憶Ｉ邋ｎ打Ｉ邐ＩＣＵＰＯ邋ｉ邋…０１邋７０６３逡逑＇．ｋＥｄ逡逑0邋，0２邐ｌ0３邐？0邐ｔｏ邐０１０邐１０邐＇邋Ｏ邐，0逡逑Ｆ邋ＩＴＣ邋Ａ邐邐＂ＴＣ邋Ａ逡逑■邋■邋－邋二邋邋邋１３４邋■■邋ｃｏ？５邋邋１邋ａａｊ邋＿ｉ３ｇ逡逑0邋，0ａ邋，0３邐，，0＊？邋，0ｓ邋ｏ邋，0ａ邋ｉｏ＊邋？0＊＊邐，0＊逡逑ＦＩＴＣ邋Ａ邐ＦＩＴＣ４逡逑圖１－２邋ＢＭＳＣｓ流式細(xì)胞術(shù)鑒定逡逑檢測(cè)ＢＭＳＣｓ特征性表面抗體陽(yáng)性率為ＣＤ４４邋（８７．７８％），邋ＣＤ９０巧８．１４％），非特征性抗體的逡逑陽(yáng)性率：ＣＤ３４（０．１４％），ＣＤ４５（０．０６％）。逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋目ＭＳＣｓ逡逑ｔｈｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｍａｒｋｅｒｓ邋ＣＤ４４（８７．７８％）
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318.08;R687

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本文編號(hào)：2546977