【摘要】：目的制備L-RADA16-RGD自組裝短肽納米羥基磷灰石復合材料,利用L-RADA16-RGD材料所形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)促進細胞增殖粘附,利用RGD基團促進成骨分化,燒結(jié)成多孔納米羥基磷灰石提供一定強度的力學支持。通過材料學檢測、體內(nèi)外實驗分析評價復合材料其結(jié)構(gòu)構(gòu)成、測試其性能、觀察其體內(nèi)外的生物安全性、生物相容性及生物活性。方法1.將n HA與發(fā)泡劑按50:1比例進行研磨混合,將混合物在1500℃的高溫條件下燒結(jié)5小時。將燒結(jié)后的n HA多孔材料采用不同模具制備力學樣條、小方片、小圓片,再與液態(tài)L-RADA16-RGD按體積比1:1混合。使用掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM),透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察材料表征。2.按照上述方法制備L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料,將小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)與復合材料進行共培養(yǎng),通過CCK-8檢測細胞增殖、流式細胞學檢測細胞周期來評價該復合材料對細胞的生物相容性及細胞毒性。3.將MC3T3-E1細胞與n HA/L-RADA16-RGD復合材料所制備的小圓片在6孔板中進行共培養(yǎng),對MC3T3-E1行成骨誘導培養(yǎng),通過茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成、蛋白免疫印跡實驗(western blot,WB)檢測I型膠原、骨橋蛋白、骨鈣素等成骨相關蛋白的表達情況,評價該生物材料的生物活性。4.在SD大鼠外側(cè)股骨髁建立骨缺損模型,分別植入由n HA/L-RADA16-RGD復合材料所制備的多孔骨填充材料及單純多孔n HA骨填充材料,觀察點設置為填充材料植入后30天、60天。采用微計算機斷層掃描(micro computed temography,Micro-CT)及組織學染色觀察植入材料周圍骨生長情況、植入材料與骨的界面結(jié)合情況,同時進行動物肝腎功生化指標檢測、肝腎組織學檢測,以綜合評價L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料的生物安全性、生物相容性及生物活性。結(jié)果1.通過SEM與TEM觀察所制備的樣本可見多孔材料表征,驗證L-RADA16-RGD多肽材料成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),觀察到L-RADA16-RGD多肽與多孔n HA材料進行物理結(jié)合,L-RADA16-RGD多肽在多孔n HA孔隙之間形成三維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu),孔隙率71.95±1.77%,孔徑大小為203±17nm。。2.通過CCK-8檢測MC3T3-E1細胞與L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料共培養(yǎng)后的細胞增殖情況,通過與多孔n HA材料組及空白對照組對比,可以得知三組的細胞增殖情況隨培養(yǎng)時間的延長均呈上升趨勢,在各觀察時間點,三組細胞的增殖情況相似,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。另外,流式細胞檢測細胞周期提示,L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料組、多孔n HA材料組及空白對照組在不同觀察時間點細胞周期情況分別為:各組中的第1天及第7天細胞周期情況相似,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),而第4天的細胞周期檢測中,L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料組處于S期及M期的細胞明顯多于多孔n HA材料組及空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.MC3T3-E1細胞在與L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料共培養(yǎng),經(jīng)21天成骨誘導培養(yǎng)后,通過茜素紅染色染色觀察發(fā)現(xiàn),肉眼觀L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料組的染色較多孔n HA材料組及對照組顏色更深,鏡下觀L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料組鈣結(jié)節(jié)生成的數(shù)量亦明顯多于多孔n HA材料組及對照組。將復合材料表面的染料洗脫并進行定量檢測,L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料組、多孔n HA材料組及對照組的吸光度分別為:0.37±0.04、0.22±0.01、0.19±0.03,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。WB檢測各成骨相關蛋白表達水平提示,在各觀察時間點,L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料組各成骨蛋白表達水平高于多孔n HA材料組及對照組,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.在骨缺損模型的分析中,Micro-CT分析結(jié)果提示,在兩個觀察時間點,L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料組及多孔n HA材料組植入物周圍的骨小梁體積(BV)、骨小梁相對體積(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)分別為:。其中BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th四組數(shù)據(jù)中,L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料組高于多孔n HA材料組,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。硬組織切片染色提示兩組植入物孔內(nèi)均有較好的骨長入,骨與植入物界面結(jié)合緊密,但L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料組植入物孔內(nèi)骨長入情況更優(yōu)。結(jié)論通過上述方法成功制備多孔n HA。通過加入L-RADA16-RGD,使復合材料的生物相容性及生物活性得到了提高。L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復合材料在體內(nèi)外實驗中均表現(xiàn)出良好的生物安全性、生物相容性及生物活性,具有進一步研究價值及前景。
【圖文】：

差異有統(tǒng)計學意義。ab圖3.1 成骨誘導前及成骨誘導后的MC3T3-E1細胞：a(×4)為成骨誘導前，b(×4)為成骨誘導后。Fig 3.1 The cellularmorphology of MC3T3-E1 cultured with DMEM/F12 (a, b) or osteogenesisinduction medium (c, d).

3.3 經(jīng)成骨誘導后成茜素紅染色情況圖 3.4 所示為茜素紅染色后肉眼及顯微鏡下觀察細胞經(jīng)成骨誘導后的鈣鹽生成情況，即成骨細胞的礦化能力。肉眼及鏡下觀，L-RADA16-RGD 納米羥基磷灰石復合材料組細胞經(jīng)成骨誘導后，生成的鈣結(jié)節(jié)更多，茜素紅染色更明顯，通過對各組染色洗脫液的吸光值測量，量化比較各組鈣結(jié)節(jié)生成情況，其中L-RADA16-RGD 納米羥基磷灰石復合材料組吸光值為 0.406 ± 0.033，空白對照組吸光值為 0.183 ± 0.026，，多孔 nHA 材料組吸光值為 0.191 ± 0.023。相比空白對照組及多孔 nHA 材料組，L-RADA16-RGD 納米羥基磷灰石復合材料組吸光值更高，差異有統(tǒng)計學意義，細胞與 L-RADA16-RGD 納米羥基磷灰石復合材料組共培養(yǎng)并經(jīng)成骨誘導后，可生成更多鈣鹽，礦化能力更強。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R318.08

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本文編號：2540630