【摘要】：背景:人工關(guān)節(jié)置換術(shù)在治療骨性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、老年髖關(guān)節(jié)骨折等方面已經(jīng)取得巨大成功,能夠明顯改善病人運(yùn)動(dòng)功能和生活質(zhì)量。磨損顆粒誘導(dǎo)的植體周圍松動(dòng)是全關(guān)節(jié)置換術(shù)病人術(shù)后最常見的遠(yuǎn)期并發(fā)癥,嚴(yán)重影響病人生存質(zhì)量。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后產(chǎn)生的磨損顆粒及副產(chǎn)物可導(dǎo)致局部的慢性炎癥反應(yīng)和異物反應(yīng)從而刺激破骨細(xì)胞分化成熟造成局部溶骨最終導(dǎo)致無(wú)菌松動(dòng)。有效的抑制破骨細(xì)胞過度分化成熟能夠改善全關(guān)節(jié)置換術(shù)成功率及遠(yuǎn)期療效。最近幾年研究發(fā)現(xiàn),植體周圍局部炎癥反應(yīng)是促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟的重要因素之一,且IL-8在破骨細(xì)胞成熟分化中起著重要作用。因此,我們課題組采用腺病毒干擾技術(shù)沉默IL-8的受體CXCR2,針對(duì)IL-8/CXCR2通路研究CXCR2在磨損顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞過度分化成熟中發(fā)揮的作用。目的:體內(nèi)構(gòu)建小鼠顱骨骨溶解模型,觀察si RNA-CXCR2是否具有抑制破骨細(xì)胞分化成熟及局部骨溶解的作用。體外培養(yǎng)原代破骨細(xì)胞和原代成骨細(xì)胞,觀察si CXCR2是否具有直接和間接調(diào)控破骨細(xì)胞分化成熟的作用。方法:1.體外實(shí)驗(yàn):(1)建立破骨細(xì)胞株(RAW264.7)培養(yǎng)體系培養(yǎng)破骨細(xì)胞株RAW264.7,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)技術(shù),觀察破骨細(xì)胞成熟分化刺激因子RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞株RAW264.7分化過程中對(duì)RAW264.7細(xì)胞表面CXCR2表達(dá)的影響。(2)建立原代破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系使用si CXCR2成功轉(zhuǎn)染原代破骨細(xì)胞后,運(yùn)用Western blot、Real-Time PCR、抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)破骨細(xì)胞標(biāo)志性蛋白及基因的表達(dá),及細(xì)胞中RANKL/RANK信號(hào)系統(tǒng)下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(c-Fo S,NFATc1,Ctsk)基因的表達(dá)變化。觀察IL-8/CXCR2通路直接調(diào)控破骨細(xì)胞成熟分化的作用。(3)建立原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系使用si CXCR2成功轉(zhuǎn)染原代成骨細(xì)胞后,運(yùn)用Western blot、Real-Time PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞中OPG、RANKL在蛋白水平及基因水平的表達(dá)情況。觀察IL-8/CXCR2通路是否作用于成骨細(xì)胞間接調(diào)控破骨細(xì)胞成熟分化的作用。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):首先構(gòu)建鈦顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨骨溶解模型。運(yùn)用Real-Time PCR、TRAP染色、免疫組織化學(xué)、micro-CT等實(shí)驗(yàn)方法,檢測(cè)各組模型局部破骨細(xì)胞數(shù)量及局部溶骨情況。觀察si CXCR2在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中是否具有抑制磨損顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞過度成熟分化,有效抑制局部溶骨的作用。結(jié)果:1.經(jīng)過RANKL刺激后的RAW264.7破骨細(xì)胞株表面CXCR2表達(dá)明顯上調(diào)。2.通過體外培養(yǎng)原代破骨細(xì)胞及原代成骨細(xì)胞,觀察到si CXCR2可以直接作用于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞抑制其向具有溶骨作用成熟破骨細(xì)胞分化,間接作用于成骨細(xì)胞,調(diào)控OPG、RANKL的表達(dá)從而抑制破骨細(xì)胞分化成熟。3.在鈦顆粒誘小鼠顱骨骨溶解模型中,通過沉默CXCR2基因的表達(dá),可以明顯抑制由于破骨細(xì)胞過度分化造成的局部骨溶解。結(jié)論:本課題證實(shí)了IL-8/CXCR2信號(hào)通路在破骨細(xì)胞成熟分化中起重要作用。局部注射重組腺病毒si CXCR2可以有效抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞過度分化成熟與局部溶骨現(xiàn)象。IL-8/CXCR2信號(hào)通路可直接和間接調(diào)控破骨細(xì)胞分化成熟并有可能成為因局部溶骨造成無(wú)菌松動(dòng)治療的新靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1 磨損顆粒誘導(dǎo)趨化因子表達(dá)和細(xì)胞遷移[12]Fig.1 Wear particles induced chemokine expression and cellular migration.

圖 1 RANKL 刺激 RAW264.7 成熟分化過程中上調(diào) CXCR2 表達(dá)e 1. CXCR2 is upregulated during RANKL-induced osteoclastogenesis in RAW264.7 cells were treated with M-CSF (30 ng/ml) with or without RANKL(100 nA. CXCR2-positive stained cells were analyzed using FACS with anti-CXCR2 atal CXCR2 protein levels were increased in the RANKLgroup. Western blottinalyze CXCR2 protein expression in cell lysates. Thirty micrograms of protein winto each lane; β-actin was used as a loading control. *P<0.05.腺病毒siCXCR2篩選重組腺病毒購(gòu)買自上海漢恒生物科技有限公司，產(chǎn)品提供了4組供選擇使用，分別標(biāo)號(hào)為 1、2、3、4。我們需要使用 Western blottin效果最好的一組病毒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過檢測(cè)發(fā)現(xiàn) 1 號(hào)病毒沉默效
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R687.4;R318.08

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本文編號(hào)：2535481