【摘要】：肺結(jié)核病是一個(gè)很古老的疾病,目前為我國(guó)的乙類(lèi)傳染性疾病,新中國(guó)成立以來(lái),結(jié)核病得到了一定程度的控制,但近年來(lái)全球肺結(jié)核病例有卷土重來(lái)之勢(shì),作為肺外結(jié)核常見(jiàn)并發(fā)癥之一的骨關(guān)節(jié)結(jié)核,由于其存在的難治性及復(fù)發(fā)性,已成為醫(yī)學(xué)上的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)治療骨結(jié)核的方法主要是全身化療與手術(shù)治療相結(jié)合,全身給藥存在著骨結(jié)核病灶處藥物濃度低以及肝腎毒性大等問(wèn)題,手術(shù)治療也存在著病灶局部的復(fù)發(fā)以及骨缺損的問(wèn)題。故一種能在病灶局部持續(xù)有效地釋放抗結(jié)核藥物,并能修復(fù)骨缺損的一種載藥支架材料在骨結(jié)核的治療中尤為重要。目前研制的不同載藥支架,都存在著載藥單一、釋藥節(jié)律過(guò)快或過(guò)慢,以及材料無(wú)法降解、成骨能力差等問(wèn)題。因此,研制出一種包埋多種藥物并能按照一定節(jié)律釋放的骨支架材料成為一大挑戰(zhàn)。載藥材料的選擇以及緩釋體系的設(shè)計(jì)是這一研究的關(guān)鍵。有序介孔材料,由于比表面積和孔容較高,孔道結(jié)構(gòu)規(guī)則有序、孔徑尺度在納米范圍、孔道表面易采用化學(xué)方法修飾以及生物相容性?xún)?yōu)良等一系列優(yōu)點(diǎn),在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的藥物載體方面具有較大的潛力。介孔生物活性玻璃(MBG)具有比傳統(tǒng)方法制備的生物玻璃更好的沉積羥基磷灰石的能力,作為具有良好生物活性的藥物載體得到廣泛研究。將MBG與高分子材料復(fù)合制備支架,不僅會(huì)克服純MBG無(wú)機(jī)支架過(guò)于脆弱的缺點(diǎn),也可改善聚合物支架的生物活性和藥物輸送性能。基于MBG材料表現(xiàn)出的良好生物活性和藥物緩釋性能,可將其應(yīng)用于載藥緩釋支架的構(gòu)建。三維打印(3D-Printing)技術(shù)可以在計(jì)算機(jī)輔助下,根據(jù)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD)模型或者電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)數(shù)據(jù),通過(guò)材料的精確堆積為臨床醫(yī)學(xué)量身定做特定生物材料制品。不同的材料及藥物可根據(jù)需要調(diào)整比例后通過(guò)粘合劑進(jìn)行混合后方便打印,可適用的成型材料類(lèi)型眾多,對(duì)于復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的支架在制備上有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì),通過(guò)逐層打印、層層疊加可精確的控制支架的結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)出來(lái)的支架材料在生物力學(xué)強(qiáng)度及孔隙率方面在一定程度上可控。由于三維打印技術(shù)在支架材料的設(shè)計(jì)上具有打印生物材料種類(lèi)多、打印精度高、集成化程度好和操作方便等特點(diǎn),在生物組織工程及藥物控釋方面得到廣泛應(yīng)用。近年來(lái)關(guān)于三維打印技術(shù)用于制備MBG支架及其復(fù)合支架已有相關(guān)報(bào)道。本研究針對(duì)骨結(jié)核術(shù)后局部骨缺損的修復(fù)及原位藥物化療的需要,采用三維打印技術(shù)設(shè)計(jì)制備裝載有異煙肼及利福平兩種抗結(jié)核藥物的MBG/PHBHHX(聚3-羥基丁酸-共-3-羥基己酸)復(fù)合支架。該支架中功能化后的不同孔徑和表面性質(zhì)的MBG可區(qū)別裝載高量的一線抗結(jié)核藥異煙肼和利福平,介孔限域、表面化學(xué)基團(tuán)以及PHBHHX的逐步降解共同作用,實(shí)現(xiàn)盡可能長(zhǎng)時(shí)間的藥物緩慢釋放。這種研究思路制備的載藥支架滿(mǎn)足聯(lián)合、高量及緩釋的臨床化療要求,不僅具有很高的科研學(xué)術(shù)價(jià)值,也具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,有望為載藥緩釋支架研究提供新的發(fā)展,具有創(chuàng)新性。實(shí)驗(yàn)第一部分:載藥復(fù)合骨支架(DLCS)的制備與表征目的:旨在通過(guò)三維打印技術(shù)制備MBG/PHBHHX載藥抗結(jié)核復(fù)合骨支架(DLCS),采用TEM及SEM手段明確其形貌特征,并對(duì)其基本的理化性能及生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)。方法:選擇三嵌段共聚物表面活性劑P123,采用揮發(fā)誘導(dǎo)自組裝方法,制備MBG粉體;在MBG的介孔孔道表面分別嫁接親水羧基和疏水甲基進(jìn)行化學(xué)改性后用于擔(dān)載抗結(jié)核藥異煙肼和利福平;將載藥MBG粉體與PHBHHX配制成合適于打印的漿料后,置于三維打印機(jī)中制備出直徑為6mm,高為8mm的圓柱體復(fù)合載藥骨支架,命名為DLCS,同時(shí)采用浸滯法制備對(duì)照組載藥支架,命名為commercial Cap。應(yīng)用掃描電鏡觀察分析復(fù)合骨支架的晶相組成及微觀形貌,檢測(cè)支架的抗壓強(qiáng)度及孔隙率等理化性能,并通過(guò)檢測(cè)DLCS沉積羥基磷灰石的能力、成骨細(xì)胞粘附的能力及其對(duì)堿性磷酸酶(ALP)活性的影響來(lái)評(píng)估DLCS的生物學(xué)活性。結(jié)果:我們采用三維打印技術(shù)成功制備出了MBG/PHBHHx載藥復(fù)合骨支架,該支架材料的孔隙率為72.55±1.91(%),發(fā)生20%行變時(shí)的平均抗壓強(qiáng)度為3.15±0.69MPa,SEM掃描顯示DLCS表面具有較多的孔隙,孔序分布均勻,孔隙率較大,層與層之間排列緊密,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。DLCS具有較好的沉積羥基磷灰石的能力,h BMSC細(xì)胞在支架表面黏附情況良好,ALP活性檢測(cè)顯示DLCS組與對(duì)照組差異不明顯(p0.05),而較空白組的ALP活性低(p0.05),這與其載藥后藥物的釋放對(duì)細(xì)胞的影響有關(guān),但隨著天數(shù)的增加,實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中的ALP活性均出現(xiàn)明顯增強(qiáng),說(shuō)明DLCS仍具備良好的成骨性能。結(jié)論:通過(guò)三維打印技術(shù)可成功制備MBG/PHBHHx載藥復(fù)合骨支架,該支架具有較好的生物學(xué)活性,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,能較好的裝載兩種抗結(jié)核藥物,且具有一定的抗壓強(qiáng)度,可為載藥人工骨支架的研究提供一種新的理論支持。實(shí)驗(yàn)第二部分:DLCS的體內(nèi)外藥物釋放特性及其對(duì)肝腎功能影響的研究目的:旨在檢測(cè)DLCS在體外模擬體液(SBF)及新西蘭大耳白兔體內(nèi)的藥物釋放節(jié)律及特性,從而評(píng)估DLCS在藥物緩釋方面的性能,并檢測(cè)其在各不同時(shí)間段對(duì)動(dòng)物機(jī)體肝腎功能的影響。方法:取DLCS及對(duì)照組材料(commercial Cap)各0.1g分別浸漬到20ml的SBF液后,置于恒溫振蕩器中。間隔相應(yīng)時(shí)間段取樣并更換同體積SBF液。用HPLC檢測(cè)并計(jì)算每次所取介質(zhì)INH、RFP的濃度,總結(jié)其在體外釋藥特性。DLCS及對(duì)照組材料各0.1g植入新西蘭大白兔的股骨下段骨缺損處,術(shù)后間隔相應(yīng)時(shí)間段取靜脈血及材料植入處周?chē)M織,采用HPLC法檢測(cè)并計(jì)算對(duì)應(yīng)INH和RFP的濃度,總結(jié)其在體內(nèi)釋藥特性。間隔相應(yīng)時(shí)間段對(duì)空白組、實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的肝腎功能進(jìn)行檢測(cè),評(píng)價(jià)材料釋藥對(duì)動(dòng)物肝腎功能的影響。結(jié)果:體外模擬實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組INH及RFP兩種藥物的釋放量在第2w左右已接近100%,而實(shí)驗(yàn)組INH和RFP分別在6w和4w左右釋放量接近80%,第10w仍未釋放完全。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示DLCS組局部濃度12w時(shí)仍在最低抑菌濃度(MIC:INH0.05μg/ml,RFP0.5μg/ml)之上,而對(duì)照組局部濃度4w時(shí)已降至最低抑菌濃度之下。血液中藥物濃度明顯低于材料周?chē)M織濃度,大部分為5ug/ml以下。肝腎功能檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)術(shù)后第7d及2w出現(xiàn)一過(guò)性升高,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中尿素氮(BUN)及肌酐(CR)值一直無(wú)明顯升高。結(jié)論:DLCS載藥量滿(mǎn)意,體外及體內(nèi)藥物緩釋節(jié)律均較對(duì)照組明顯緩慢,釋放性能穩(wěn)定,在體內(nèi)局部組織中有效抑菌時(shí)間可達(dá)12w以上,可滿(mǎn)足骨結(jié)核術(shù)后局部化療的需要。DLCS的釋藥過(guò)程對(duì)新西蘭兔肝腎功能影響不大,僅對(duì)AST及ALT有一過(guò)性影響。實(shí)驗(yàn)第三部分:DLCS的生物安全性及成骨能力研究目的:對(duì)DLCS的生物安全性進(jìn)行評(píng)估,以證實(shí)其符合生物材料的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn);對(duì)DLCS的動(dòng)物體內(nèi)成骨性能進(jìn)行檢測(cè),以證實(shí)其修復(fù)骨缺損的能力。方法:采用CCK-8法檢測(cè)DLCS的細(xì)胞毒性,并在動(dòng)物體內(nèi)行DLCS的急性全身毒性實(shí)驗(yàn)、原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)和致敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè),評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)材料的生物相容性和安全性。同實(shí)驗(yàn)第二部分,建立兔股骨骨缺損模型,實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白組各兩組,每組3只,術(shù)后6w及12w分批處死,大體觀察后,取骨缺損區(qū)域組織行Micro-CT掃描及硬組織切片檢查,研究DLCS對(duì)骨缺損的修復(fù)能力。結(jié)果:CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示各個(gè)時(shí)間段細(xì)胞的存活率CV均在80%以上,依據(jù)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估為1級(jí),符合生物材料使用標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物急性全身毒性實(shí)驗(yàn)、原發(fā)性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)和致敏實(shí)驗(yàn)均顯示DLCS毒性較低,與機(jī)體具有較好的生物相容性,生物安全性良好。在兔股骨骨缺損修復(fù)過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)組和材料對(duì)照組修復(fù)情況類(lèi)似,較空白組具有明顯優(yōu)勢(shì)。結(jié)論:DLCS無(wú)明顯細(xì)胞毒性,具有良好的生物相容性和安全性,對(duì)細(xì)胞的毒性評(píng)估符合生物材料使用標(biāo)準(zhǔn)。DLCS具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨能力,其應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核術(shù)后骨缺損的治療,能促進(jìn)骨缺損的愈合,具有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

10]，其加載藥物方式與前述圖1中c線路類(lèi)似，即將藥物粉體和載體材料粉體機(jī)械混合或是溶解到聚合物溶液中，再一次性進(jìn)行支架成型。這種單一的混合方式難以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同藥物的區(qū)別裝載及可控釋放。因此，研究開(kāi)發(fā)符合高量聯(lián)合裝藥及可控釋放要求的抗結(jié)核藥物緩釋支架，，仍是非常具有挑戰(zhàn)性的工作，其中藥物載體材料的選擇和支架結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵所在。圖 1 骨內(nèi)植入支架載藥的不同途徑示意圖二、介孔生物活性玻璃（MBG）在骨組織工程中的應(yīng)用有序介孔材料，由于具有極高的比表面積和孔容，規(guī)則有序的孔道結(jié)構(gòu)、可調(diào)的納米尺度孔徑、易于化學(xué)修飾的孔道表面以及優(yōu)良的生物相容性等一系列優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的藥物載體方向展現(xiàn)出巨大的潛力[11-12]。介孔材料的孔徑大小、孔道類(lèi)型、比表面積等參數(shù)則會(huì)影響到藥物的負(fù)載和釋放特性。但是，介孔氧化硅因?yàn)闆](méi)有生物活性或者說(shuō)生物活性很低[13]，并不適用于骨組織工程。2004 年

第四代3D-Bioplottersystem(EnvisionTEC,Germany)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R687;R318.08

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7 張承e

本文編號(hào)：2525240