【摘要】：研究背景:關節(jié)骨軟骨組織是人體關節(jié)重要的負重組織,關節(jié)疾病及創(chuàng)傷導致的關節(jié)骨軟骨損傷十分常見,是導致關節(jié)疼痛、功能障礙甚至肢體殘疾的主要疾病,給病人及社會帶來了沉重的負擔。Curl等回顧性分析了31516例行膝關節(jié)鏡手術的患者,63%的患者發(fā)現(xiàn)有軟骨損傷。由于透明軟骨組織無血液供應,缺乏祖細胞聚集途徑,一旦損傷,難以自身修復�，F(xiàn)有的臨床治療策略包括:保守治療、關節(jié)腔清理術、微骨折術、軟骨細胞移植、自體或異體骨軟骨移植及人工關節(jié)置換等技術,但以上治療策略均存在有明顯的缺陷,長期治療效果難以令人滿意。目前常用的治療策略以微骨折術為代表,它通過破壞鈣化軟骨層結構,使得軟骨缺損由血凝塊所填充,而該血凝塊中富含骨髓來源的間充質干細胞,間充質干細胞進入骨軟骨缺損區(qū)增殖并分化為纖維軟骨細胞,刺激骨軟骨缺損區(qū)域纖維軟骨修復。以達到緩解癥狀,填充缺損,延緩OA的發(fā)生等作用,但其遠期療效欠佳。而骨軟骨移植及軟骨細胞移植由于組織、細胞來源有限,且會造成供區(qū)損傷,制約了其應用。人工關節(jié)置換術創(chuàng)傷較大,適用于嚴重的關節(jié)骨軟骨損傷或終末期關節(jié)疾病軟骨大量破壞的情況下,術后并發(fā)癥及假體長期生存率仍有待提高。組織工程骨軟骨技術是以再生醫(yī)學方式治療關節(jié)骨軟骨損傷最為理想的新方法。但現(xiàn)階段工程化的骨軟骨組織與宿主組織整合較差、存在纖維軟骨樣退變、力學性能較低下,難以確保其治療關節(jié)骨軟骨損傷的長期有效性。我們認為導致以上現(xiàn)象的主要原因是現(xiàn)階段構建的工程化骨軟骨組織在結構和功能上都存在有明顯的缺陷,特別是缺少透明軟骨層與軟骨下骨層之間的界層連接結構,即:鈣化軟骨層結構。鈣化軟骨層是介于透明軟骨層與軟骨下骨層之間的界層連接結構,通過上方的波浪形潮線結構及下方的不規(guī)則粘合線結構與透明軟骨層及軟骨下骨層緊密鉚合[1]。鈣化軟骨層由大量的有機膠原纖維及無機礦物質組成,其結構致密,平均厚度為104.16±20.87μm,在物質通透及力學傳導等方面發(fā)揮重要功能。研究發(fā)現(xiàn)鈣化軟骨層具有隔離帶的作用,其隔離帶作用具有阻止成骨性和成軟骨性細胞相互遷移,使其于特定區(qū)域增殖并定向分化,為成骨和成軟骨提供獨立的生長微環(huán)境。在骨關節(jié)炎病理發(fā)病過程的早期可觀察到鈣化軟骨層發(fā)生穿孔,并伴有血管、神經(jīng)的長入及通透性的改變,同時潮線發(fā)生復制及漂移等現(xiàn)象。因此在骨軟骨組織工程研究中,構建出含致密鈣化軟骨層結構的復合支架可能具有重要意義。因此,在對鈣化軟骨層的形態(tài)結構及生理功能認識的基礎上,我們提出了一體化構建包括透明軟骨層、鈣化軟骨層及軟骨下骨層的三層仿生骨軟骨支架的新理念。利用脫細胞骨支架復合Ⅱ型膠原蛋白水凝膠,采用凍干交聯(lián)的方法制備含天然鈣化層結構的仿生型骨軟骨支架。一體化構建就是在支架制備的過程中使軟骨支架與骨支架直接結合成整體。同時,為了給軟骨層及軟骨下骨層提供獨立的培養(yǎng)微環(huán)境,我們在構建的含天然鈣化層結構的仿生型骨軟骨支架的基礎上,以聚乳酸(Polylactic acid,PLA)為原材料,運用計算機輔助設計(Computer aided design,CAD)技術及三維打印快速成型技術(3DP)構建了雙室培養(yǎng)系統(tǒng)。為驗證該雙室培養(yǎng)系統(tǒng)的可行性,并進一步證明鈣化軟骨層的隔離帶作用。我們以人羊膜間充質干細胞為種子細胞,接種于含天然鈣化層結構的仿生型骨軟骨支架上,并通過雙室培養(yǎng)系統(tǒng)為軟骨層及軟骨下骨層提供成軟骨及成骨誘導培養(yǎng)基。通過細胞示蹤技術、組織切片技術、PCR技術等實驗手段檢測種子細胞在支架內(nèi)的粘附、增殖、分化及遷移等生物學行為。最后,我們選取實驗動物進行骨軟骨缺損造模,使用經(jīng)雙室培養(yǎng)后的含種子細胞的骨軟骨支架植入該骨軟骨缺損,觀察該仿生型骨軟骨支架在修復骨軟骨缺損中的作用,并與空白對照及不含鈣化層骨軟骨支架的修復效果相對比。第一部分含天然鈣化軟骨層仿生組織工程骨軟骨支架的制備及檢測本部分研究中,我們鉆取正常豬膝關節(jié)股骨髁負重面骨軟骨柱,削去骨柱透明軟骨部分。切下的透明軟骨用于Ⅱ型膠原蛋白提取,而含鈣化軟骨層的軟骨下骨柱行脫細胞處理。然后將提取的Ⅱ型膠原蛋白水凝膠接種于鈣化層之上,經(jīng)過凍干及交聯(lián)等步驟,獲得含天然鈣化層的仿生骨軟骨支架,并對支架相關特性進行檢測。一、實驗方法1.含天然鈣化軟骨層骨柱的制備及檢測(1)鉆取直徑為12 mm的含有天然鈣化軟骨層結構的骨柱,削去透明軟骨層;(2)Triton X-100脫去骨柱中的細胞;(3)HE染色及DAPI染色觀察骨柱中細胞是否洗脫干凈。2.Ⅱ型膠原蛋白水凝膠的制備(1)獲取透明軟骨粉;(2)胃蛋白酶消化,鹽析及透析。3.骨軟骨支架的制備及檢測(1)三維打印構建骨軟骨支架制備模具;(2)通過模具在脫細胞骨支架上灌注Ⅱ型膠原蛋白水凝膠,再通過凍干、交聯(lián)等步驟制備骨軟骨支架;(3)檢測支架孔隙率、孔徑、細胞毒性及結構特征。二、實驗結果構建的骨軟骨支架呈深藍色,細胞洗脫徹底,Ⅱ型膠原蛋白海綿支架平均孔隙率為(96.1±3.8)%,掃描電鏡下測其孔徑平均大小為(102.3±35.3)μm,脫細胞軟骨下骨支架的平均孔隙率為(73.5±2.6)%,其平均孔徑大小為(470.2±158.8)μm,呈多孔網(wǎng)狀結構,孔隙結構良好,孔孔相通。支架浸提液對細胞生長無明顯影響。第二部分含天然鈣化軟骨層仿生支架雙室培養(yǎng)系統(tǒng)的構建本部分研究中,為了給軟骨層及軟骨下骨層提供獨立的培養(yǎng)微環(huán)境,我們設計了基于鈣化軟骨層的雙室培養(yǎng)系統(tǒng),利用鈣化軟骨層的隔離帶作用,為軟骨腔及軟骨下骨腔分別提供成軟骨及成骨培養(yǎng)基。在成軟骨及成骨的環(huán)境中,誘導間充質干細胞分別向軟骨細胞及成骨細胞的方向分化。這種雙室培養(yǎng)系統(tǒng)更加符合骨軟骨組織的生理特征,因此可能構建出更加仿生的骨軟骨缺損修復材料。一、實驗方法1.雙室培養(yǎng)裝置的構建(1)運用計算機輔助設計技術設計雙室培養(yǎng)系統(tǒng)的計算機三維模型;(2)運用三維打印技術制備雙室培養(yǎng)系統(tǒng)各部件;(3)組裝雙室培養(yǎng)系統(tǒng),并進行密閉性測試,Co60輻照滅菌。2.人羊膜間充質干細胞培養(yǎng)I型膠原酶消化法獲取人羊膜間充質干細胞,差速消化法進行純化。3.人羊膜間充質干細胞復合支架共培養(yǎng)(1)CFDA SE及Di I標記人羊膜間充質干細胞;(2)細胞懸液接種法及凝膠接種法接種CFDA SE標記的細胞于膠原層,Di I標記的細胞于軟骨下骨層,并進行雙室培養(yǎng);(3)通過病理切片、熒光定量PCR、支架總DNA含量檢測等手段,檢測支架中細胞粘附、生長、增殖、分布及分化情況。二、實驗結果雙室培養(yǎng)7天后,熒光顯微鏡下可觀察到膠原層CFDA SE標記的綠色熒光細胞,軟骨下骨層Di I標記的紅色熒光細胞,綠色熒光細胞與紅色熒光細胞分別位于鈣化軟骨層兩邊,無跨鈣化層細胞遷移現(xiàn)象。熒光定量PCR檢測膠原層內(nèi)種子細胞的成軟骨標志物隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增加,軟骨下骨層內(nèi)種子細胞的成骨標志物隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增加。支架中種子細胞總DNA含量隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加,因此表明隨著雙室培養(yǎng)時間的延長,支架內(nèi)種子細胞的數(shù)量逐漸增加。第三部分骨軟骨支架動物實驗在前面的研究基礎上,為了進一步驗證該含天然鈣化層仿生骨軟骨支架對關節(jié)骨軟骨損傷的修復效果。在本部分研究中我們選擇貴州小香豬為實驗動物,通過手術方法行膝關節(jié)股骨髁負重面骨軟骨缺損造模。植入經(jīng)雙室培養(yǎng)的含天然鈣化層的仿生骨軟骨支架,觀察其修復效果,并與空白對照及無天然鈣化層仿生骨軟骨支架的修復效果進行對比。一、實驗方法1.含天然鈣化層仿生骨軟骨支架雙室培養(yǎng)(1)Percoll密度梯度離心法獲取豬BMSCs;(2)復合支架進行雙室培養(yǎng)。2.骨軟骨缺損造模及修復(1)30頭貴州小香豬隨機分為3組,每組20膝,共60膝;(2)造模,A組為空白對照組(單純骨軟骨缺損);B組為不含鈣化層骨軟骨支架修復組;C組為含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架修復組;3.修復效果評估體視顯微鏡觀察,核磁共振檢查,HE染色,固綠—番紅O染色,天狼星紅染色及O’Driscoll組織學評分評估骨軟骨缺損修復效果。二、實驗結果與空白對照及不含鈣化層骨軟骨支架相比,含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架在修復骨軟骨缺損中具有良好的修復效果。含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架修復組中軟骨下骨層修復組織與宿主組織無明顯差異,可見完整的鈣化軟骨層結構。但軟骨缺損部位仍有部分凹陷,修復組織表面并未與關節(jié)表面平齊。結論:通過低溫凍干及京尼平交聯(lián)技術,利用含天然鈣化軟骨層脫細胞骨基質及II型膠原蛋白水凝膠可構建出含完整鈣化層結構的三層仿生骨軟骨支架,該支架結構良好,無明顯細胞毒性。其鈣化軟骨層具有生理性隔離帶作用,利用其生理性隔離帶作用,我們構建的雙室培養(yǎng)系統(tǒng)能為軟骨層及軟骨下骨層提供獨立的生長微環(huán)境。種子細胞在含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架中生長良好,在誘導分化培養(yǎng)基的作用下,軟骨層及軟骨下骨層中的間充質干細胞可分別向成軟骨及成骨方向分化,且隨著培養(yǎng)時間的延長,支架內(nèi)種子細胞含量逐漸增加。在骨軟骨缺損修復實驗中,與空白對照及不含鈣化層骨軟骨支架相比,含天然鈣化軟骨層的骨軟骨支架在修復骨軟骨缺損中具有良好的修復效果,其修復組織結構及成分與正常骨軟骨組織類似。
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學博士學位論文泡于含蛋白酶抑制劑的 10 mM Tris-HCl (PH 7.4) 液中待用。2.1.2.2 含鈣化軟骨層骨柱的脫細胞處理① 將清洗后的含天然鈣化軟骨層結構的骨柱置于 10 倍以上體積的含蛋白酶抑制劑的 1% Triton X-100 溶液中，放于恒溫搖床上震蕩洗脫 24 h，，溫度設定為 30℃，搖床速度設定為 200 轉/min；② 24 h 后用含蛋白酶抑制劑的 10 mM Tris-HCl (PH 7.4) 溶液高速離心清洗 3 次③ 重新加入新的10倍以上體積含蛋白酶抑制劑的1% Triton X-100液繼續(xù)行細胞洗脫處理，如此反復 3 次，共洗脫 72 h。再用 PBS 溶液高速離心清洗 3 次，可見骨柱由紅色逐漸洗脫變白。4℃冰箱保存待用。

第三軍醫(yī)大學博士學位論文泡于含蛋白酶抑制劑的 10 mM Tris-HCl (PH 7.4) 液中待用。2.1.2.2 含鈣化軟骨層骨柱的脫細胞處理① 將清洗后的含天然鈣化軟骨層結構的骨柱置于 10 倍以上體積的含蛋白酶抑制劑的 1% Triton X-100 溶液中，放于恒溫搖床上震蕩洗脫 24 h，溫度設定為 30℃，搖床速度設定為 200 轉/min；② 24 h 后用含蛋白酶抑制劑的 10 mM Tris-HCl (PH 7.4) 溶液高速離心清洗 3 次③ 重新加入新的10倍以上體積含蛋白酶抑制劑的1% Triton X-100液繼續(xù)行細胞洗脫處理，如此反復 3 次，共洗脫 72 h。再用 PBS 溶液高速離心清洗 3 次，可見骨柱由紅色逐漸洗脫變白。4℃冰箱保存待用。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R687

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本文編號：2522835