【摘要】：卵母細(xì)胞成熟要經(jīng)歷兩次減數(shù)分裂過(guò)程，染色質(zhì)逐漸卷曲凝聚成染色體。此過(guò)程中染色體構(gòu)象(指染色體空間位置、形態(tài)、分布等)經(jīng)歷了許多復(fù)雜變化。如何可視化并原位定量分析染色體構(gòu)象的“時(shí)-空”四維發(fā)育特點(diǎn)，對(duì)認(rèn)識(shí)復(fù)雜的遺傳與變異過(guò)程，及探討重大疾病的機(jī)理有重要作用。由于卵母細(xì)胞體積大、光散射強(qiáng)、對(duì)發(fā)育環(huán)境敏感，因此要在微干擾條件下，原位觀測(cè)并量化分析卵母細(xì)胞染色體三維構(gòu)象隨發(fā)育的變化特點(diǎn)，存在較大困難，目前此類研究較少。 本文利用穿透能力強(qiáng)、光損傷性小、三維分辨率高的雙光子熒光成像系統(tǒng)和圖像重構(gòu)技術(shù)，提出量化分析卵母細(xì)胞染色體構(gòu)象的方法，嘗試通過(guò)染色體體積、表面積、類球因子（RF）、平均距離、粘連程度、包裹染色體圓柱的高寬比（H/D）等指標(biāo)定量描述染色體的形態(tài)、形貌、空間分布等構(gòu)象特點(diǎn)。并將該方法應(yīng)用于誘發(fā)有機(jī)體生理環(huán)境改變的內(nèi)因“衰老”和外因“氨甲喋呤（MTX）”對(duì)小鼠卵母細(xì)胞染色體構(gòu)象影響的研究中。 我們的研究結(jié)果表明：衰老導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降。在第一次減數(shù)分裂前中期和中期，衰老干擾染色體的正常凝聚，引起染色體平均體積和表面積增大，平均距離縮短，粘連加重，形成團(tuán)狀體。在第二次減數(shù)分裂中期，衰老增加了小鼠體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞染色體錯(cuò)誤排列的幾率，并造成染色體的總體積、總表面積、H/D值增大。衰老還影響了卵胞質(zhì)內(nèi)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白的空間定位及表達(dá)水平。 MTX是常用的抗腫瘤藥物，但其具有干擾葉酸代謝功能，可能引起生殖異常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射MTX可造成小鼠體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞染色體異�？臻g排布比率升高、紡錘體形態(tài)改變。亞葉酸鈣和自身代謝兩種回救方式都可緩解MTX對(duì)體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的毒副影響，恢復(fù)染色體空間排布及紡錘體形態(tài)至正常狀態(tài)。 本文還提出一種實(shí)時(shí)觀測(cè)減數(shù)分裂紡錘體四維運(yùn)動(dòng)的便捷方法，并通過(guò)空間位置、速度、加速度等指標(biāo)量化分析其運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)。該方法基于我們觀察到的一種重要實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：無(wú)損染料Fura-2標(biāo)記小鼠活卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子，由于Fura-2與鈣離子結(jié)合后雙光子激發(fā)截面減小，鈣離子的聚集使第一次減數(shù)分裂中期染色體赤道板兩側(cè)的紡錘體區(qū)域，形成兩個(gè)對(duì)稱熒光弱區(qū)。此現(xiàn)象即熒光弱區(qū)與紡錘體共定位，通過(guò)實(shí)時(shí)追蹤活卵母細(xì)胞內(nèi)熒光弱區(qū)的運(yùn)動(dòng)，可獲知紡錘體的動(dòng)態(tài)行為。
【圖文】：

.1 Jablonski 能級(jí)圖。S 代表自旋單重態(tài)，T 代表自旋三重態(tài)。S0、S1、S2、T1代同電子能級(jí)。v=0-5 代表不同振動(dòng)能態(tài)。.2 熒光產(chǎn)生的其他相關(guān)概念1.熒光漂白

4.熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜[26, 30, 34]熒光激發(fā)光譜是指物質(zhì)發(fā)射熒光強(qiáng)度隨激發(fā)光波長(zhǎng)變化而得到的光譜（圖2.2）。該光譜反映的是熒光物質(zhì)在固定的最大熒光強(qiáng)度所對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)處，通過(guò)改變激發(fā)光的波長(zhǎng)，檢測(cè)熒光強(qiáng)度隨激發(fā)光波長(zhǎng)的變化關(guān)系。激發(fā)光譜顯示熒光物質(zhì)的有效吸收波長(zhǎng)范圍，，同時(shí)顯示出熒光強(qiáng)度與激發(fā)光波長(zhǎng)之間的依賴關(guān)系。故此本質(zhì)上激發(fā)光譜體現(xiàn)的是不同波長(zhǎng)入射光激發(fā)熒光的相對(duì)效率。另外熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與吸收光譜形態(tài)相同，二者可相互替代，物理含義相同。熒光發(fā)射光譜又稱熒光光譜，是反映物質(zhì)發(fā)射熒光強(qiáng)度與熒光波長(zhǎng)間關(guān)系的譜線（圖 2.2）。熒光光譜是在固定激發(fā)光波長(zhǎng)下記錄熒光物質(zhì)發(fā)射不同波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度，它體現(xiàn)了發(fā)射熒光中各種波長(zhǎng)組分的相對(duì)強(qiáng)度。對(duì)于絕大多數(shù)熒光物質(zhì)，其發(fā)射光譜形狀與入射光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。這是因?yàn)闊晒猱a(chǎn)生在高電子能級(jí)的最低振動(dòng)態(tài)與基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)之間，而與熒光物質(zhì)分子被激發(fā)至高電子能級(jí)的哪一振動(dòng)態(tài)無(wú)關(guān)。物質(zhì)的激發(fā)與發(fā)射光譜反映了該物質(zhì)基態(tài)與激發(fā)態(tài)間能量的躍遷。物質(zhì)吸收入射光從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)的過(guò)程可由激發(fā)光譜表征，隨后釋放能量從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的過(guò)程又可用發(fā)射光譜表征。在熒光物質(zhì)的使用過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)其激發(fā)與發(fā)射光譜，選擇能夠激發(fā)出最大熒光強(qiáng)度的入射光波長(zhǎng)，同理選擇最靈敏的發(fā)射光波長(zhǎng)用于檢測(cè)。另外物質(zhì)的激發(fā)與發(fā)射光譜還可用于鑒別該熒光物質(zhì)。因?yàn)槊糠N熒光物質(zhì)都有特定的激發(fā)與發(fā)射光譜。
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R321.1;R318.51

【參考文獻(xiàn)】

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1 李穎;楊柳;楊文方;;出生缺陷的相關(guān)因素[J];中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志;2010年12期

2 毛崢樂(lè);王琛;程亞;;超分辨遠(yuǎn)場(chǎng)生物熒光成像——突破光學(xué)衍射極限[J];中國(guó)激光;2008年09期

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本文編號(hào)：2519924