【摘要】：研究背景 各種原因所致的肝功能衰竭嚴重威脅著人類健康,原位肝移植由于費用昂貴、供體短缺限制其在臨床的應用。生物人工肝支持系統(tǒng)借助體外裝置暫時替代肝臟功能,直至自體肝臟功能恢復或進行肝移植,是目前肝衰竭治療研究的熱點之一。肝細胞是生物人工肝支持系統(tǒng)的核心部分,從生物工程學角度講,用于生物人工肝的理想肝細胞要人源性、表型正常,容易獲得和培養(yǎng),能在體外迅速生長增殖至高密度,保持良好的分化狀態(tài),具有成熟肝細胞的所有生物代謝功能。由于人原代肝細胞存在體外培養(yǎng)條件苛刻、存活時間有限、增殖傳代困難及來源短缺等問題,因此,構建一個增殖能力強且具備良好分化功能的人肝細胞系對生物人工肝的發(fā)展是至關重要的。 人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)的激活是細胞永生化的重要步驟。通過轉入外源性基因hTERT到端粒酶陰性細胞中可以恢復目的細胞端粒酶的活性,使細胞的端粒長度得到修復和保持,進而延長細胞在體外培養(yǎng)條件下的壽命,甚至發(fā)展為永生化。Caspase-3是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白酶,處于凋亡級聯(lián)反應通路的核心位置,是細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應的必經(jīng)之路。借助siRNA技術手段沉默Caspase-3的表達,有可能通過慢病毒載體轉染人原代肝細胞,所構建的永生化人肝細胞在基因組的保真性和穩(wěn)定性、細胞的合成代謝功能方面均具有較好的優(yōu)勢。 本研究采用細胞永生化和抗調亡原理,應用基因克隆、RNAi干擾、慢病毒表達載體等技術構建hTERT基因與Caspase-3RNAi兩個慢病毒載體,利用慢病毒表達載體對原代培養(yǎng)的正常人肝細胞穩(wěn)定轉染人端粒酶逆轉錄酶基因和抑制Caspase-3表達的siRNA,建立永生化人肝細胞株HepGL,并對其生物學特性及某些功能進行研究,評價其作為生物人工肝種子細胞的可行性。 全文共分五章： 第一章慢病毒載體pLENT6.3/V5-hTERT-IRES-RFP的構建 目的： 利用慢病毒載體構建攜帶有目的基因人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)和標記基因紅色熒光蛋白(RFP)的真核表達載體pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP,為基因轉染人原代肝細胞奠定實驗基礎。 方法： ①慢病毒phTERT-IRES-RFP的構建和鑒定：PCR擴增hTERT基因并克隆入pIRES-RFP載體,通過BglⅡ和EcoRI酶切,克隆入pIRES-RFP載體的BglⅡ和EcoRI位點之間。PCR產物經(jīng)純化、酶切后膠回收,以質粒pIRES-RFP為模板,通過載體酶切,T4-DNA連接酶反應。將連接產物轉化大腸桿菌DH5a,卡那霉素篩選,挑取陽性克隆行PCR、酶切及測序驗證phTERT-IRES-RFP質粒。 ②pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP重組載體的構建和鑒定：PCR擴增hTERT-IRES-RFP片段并克隆入pLenti6.3-MCS-V5慢病毒載體,通過用BglⅡ和Nhel酶切,克隆入pLenti6.3-MCS-V5載體的BamHI和NheⅠ位點之間。PCR產物經(jīng)純化、酶切后膠回收,以pLenti6.3-MCS-V5慢病毒載體為模板,通過載體酶切,T4-DNA連接酶反應。將連接產物轉化入大腸桿菌STB13感受態(tài),挑取單菌落擴增培養(yǎng),提取質粒,并進行測序證實pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP載體。 ③含hTERT-RFP病毒顆粒上清的包裝和收集：利用脂質體轉染法將慢病毒表達載體pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP、包裝質粒(含pLP1, pLP2和pLP/VSVG三個質粒)共轉染293FT細胞,包裝收集病毒,濃縮,滴度測定。 結果： ①慢病毒phTERT-IRES-RFP的構建和鑒定結果：本實驗成功擴增長達約3.4Kbp的hTERT片段,行PCR,酶切及測序鑒定,證實hTERT已克隆入pIRES-RFP載體,并成功獲得phTERT-IRES-RFP產物。 ②LENT6.3/V5-htert-IRES-RFP重組載體的構建和鑒定結果：經(jīng)PCR擴增hTERT-IRES-RFP片段并克隆入pLenti6.3-MCS-V5慢病毒載體構建得慢病毒重組質粒pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP,將重組質粒測序,證實重組質粒pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP構建成功。 ③含hTERT-RFP病毒顆粒上清液的制備結果：將pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP與包裝質粒共轉染293FT細胞,終止轉染72h后收集上清液,即得含hTERT-RFP病毒顆粒的上清液。根據(jù)滴度計算公式計算得到慢病毒的滴度為5.88x106TU/mL 結論： 成功利用慢病毒載體構建攜帶hTERT基因的真核表達載體pLENT6.3/V5-htert-IRES-RFP。 第二章Caspase-3siRNA慢病毒載體的構建 目的： 構建針對目的基因Caspase-3序列表達的RNAi DNA質粒載體,并篩選出有效的干擾靶點并進行慢病毒載體包裝。 方法： ①siRNA干擾載體的構建：針對目的基因caspase-3基因序列,利用公用網(wǎng)站按照RNA干擾序列設計原則,設計4對siRNA干擾靶點序列,分別為SR_1\SR_2\SR_3、SR_4, SR_neg (C-)為陰性對照,將4對雙鏈的siRNA oligo分別插入到siRNA表達載體pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,構建4個siRNA表達質粒,并轉化至感受態(tài)細胞DH5α。用載體通用引物進行菌落PCR篩選得到的陽性克隆進行測序,驗證重組克隆中插入片段序列與設計的oligo序列一致,擴增質粒備用。 ②iRNA干擾載體的轉染與篩選：應用干擾質粒瞬時轉染處于對數(shù)生長期的HEK293細胞,24h后觀察熒光表達情況；運用qPCR和Weatern Blot檢測各干擾質粒在基因和蛋白水平對目的蛋白的抑制水平。根據(jù)qPCR的結果,pcDNATM6.2-GW/EmGFPmi-SR_2瞬時轉染后,對目的基因的抑制效果最為明顯。 ③慢病毒表達載體構建、包裝：應用Gateway重組技術構建慢病毒表達載體pLENT6.3/V5-SR_2。經(jīng)過比對,重組的慢病毒載體中oligo序列完全正確。慢病毒載體的構建成功,擴增質粒備用；利用慢病毒包裝細胞293FT細胞,包裝病毒,測定滴度。 所得實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±SD)表示,取檢驗性顯著水準a=0.05,用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,采用One-Way ANOVA對實時熒光定量RT-PCR結果進行單因素方差分析,樣本方差齊性時選用LSD法進行組間多重比較,方差不齊時則選用Tamhane's T2法進行比較。 結果： ①設計4個干擾靶點,分別為分別為SR_1、SR_2、SR_3、SR_4, SR_neg(C-)為陰性對照,并與siRNA表達載體pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR成功連接,構建4個siRNA表達質粒質粒成功連接；②經(jīng)過測序對比,構建的4個針對caspase-3的RNAi質粒載體成功,并成功擴增和抽提；③經(jīng)過qPCR檢測,單因素方差分析顯示,4個siRNA轉染顯著地影響了HEK293細胞中Caspase-3表達(Welch=27965.102,組間多重比較(Tamhane's T2法)結果顯示：siRNA2轉染HEK293細胞后Caspase-3mRNA相對表達量為(9.84±0.461,P0.001),對目的基因的抑制效果最為明顯。④使用Gateway重組技術構建慢病毒表達載體pLENT6.3/V5-SR_2檢測測序序列完全正確,慢病毒載體的構建成功。⑤慢病毒的經(jīng)包裝后滴度測定為3.6x105TU/ml。 結論： 成功構建針對Caspase-3基因的siRNA慢病毒載體。 第三章人原代肝細胞分離培養(yǎng) 目的： 建立人原代肝細胞體外分離方法。 方法： 采用多點穿刺灌注的方法,將預溫38℃的前灌流液以及Ⅱ型膠原酶溶液灌注入人肝臟組織中,經(jīng)過消化及離心后獲得人原代肝細胞；倒置顯微鏡和電鏡觀察細胞形態(tài)特征,并進行鑒定：臺盼藍及吖啶橙／碘化丙啶染色鑒定細胞活力,PAS (periodicacid-Schiff, PAS)染色觀察細胞肝糖元的含量,免疫細胞化學鑒定肝細胞ALB表達。 結果： 平均大小為3cm×2cm×1cm的肝組織塊經(jīng)多點穿刺灌注法消化分離后,可獲得約5×105個肝細胞,分離獲得的細胞活率達90%；細胞培養(yǎng)24小時后呈鋪路石樣生長,無增殖現(xiàn)象,電鏡示肝細胞呈典型的細胞核大,胞質少；培養(yǎng)的肝細胞PAS糖原染色陽性；ALB表達陽性。 結論： 多點穿刺灌注法分離人原代肝細胞,方法簡單易行,且肝細胞產量高、活力好、純度高,培養(yǎng)的肝細胞具有特異性生物學功能表達,適宜在一般條件實驗室推廣應用。 第四章永生化人肝細胞株的建立及鑒定 目的： 研究慢病毒介導人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)基因和Caspase-3siRNA異時先后轉染人原代肝細胞構建永生化人肝細胞株HepGL并進行形態(tài)和功能學鑒定。 方法： 將表達h-TERT基因的重組慢病毒感染人原代肝細胞,通過殺稻瘟篩選獲得陽性克隆,獲得HepGL-H肝細胞；用含Caspase-3-siRNA的慢病毒液感染HepGL-H細胞構建永生化人肝細胞HepGL,并分別通過倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察轉染前后肝細胞形態(tài)變化及生長增殖情況；PAS (peri odicacid-Schiff, PAS)染色觀察細胞肝糖元的含量,免疫細胞化學鑒定肝細胞ALB表達。分析其染色體核型;RT-PCR測定其相關功能基因和表面標志基因表達；通過全自動生化分析儀測定HepGL細胞培養(yǎng)上清中ALT.AST.尿素濃度變化；繪制HepGL細胞生長曲線。 結果： 所建立的永生化人肝細胞株HepGL具有原代肝細胞的典型形態(tài)特征,而且具有較好的增殖能力,染色體核型分析表明細胞核型無明顯異常；RT-PCR檢測HepGL表達hTERT.P4503A.albumin.ASGPR.GS.GST-π兀.HBCF-X.HNF4. CK18mRNA的肝細胞生物學特性；全自動生化分析儀測定HepGL細胞培養(yǎng)上清中ALT、AST濃度隨著培養(yǎng)時間的延長呈遞減趨勢,尿素則呈逐漸遞增趨勢。 結論： 本研究建立的永生化人肝細胞株HepGL具有與原代肝細胞類似的形態(tài)特征和生物學功能,可以成為生物人工肝及肝細胞移植研究中理想的種子細胞材料。 第五章永生化人肝細胞株的安全性研究 目的：探討永生化人肝細胞株HepGL有無致瘤性。 方法： 實驗分為HepGL組和C3A組兩組,按隨機數(shù)目表法完全隨機分配,每組裸鼠10只。兩組分別在裸鼠的頸部、后背部皮下以0.2ml,2.0×106個HepGL和C3A細胞,觀察皮下組織致瘤情況。每天測量瘤體大小,5周后切取注射部位瘤組織及腦、肝、肺、腎組織標本。 結果： HepGL組未見接種部位出現(xiàn)種植瘤,組織學觀察表明接種區(qū)組織結構與未接種部位無明顯區(qū)別,肝、肺、腦、腎組織切片無轉移。C3A組共有20個接種部位出現(xiàn)腫瘤,致瘤率為100%,裸鼠皮下種植瘤細胞形態(tài)大小均一,細胞核深染,核分裂相較多,細胞呈梁狀排列。 結論： 永生化人肝細胞株HepGL無致瘤性,具備良好的應用安全性。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R318

【參考文獻】

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本文編號：2516868