【摘要】：研究背景和目的 自20世紀(jì)60年代Branemark教授提出“骨結(jié)合(Osseointegration)"理論,并于1965年首次使用鈦金屬牙種植體植入人類頜骨完成牙缺失修復(fù)至今,鈦種植體作為口腔牙列修復(fù)的種植材料獲得了飛速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)在,口腔種植修復(fù)作為一門理論成熟的技術(shù),已經(jīng)取得了令人滿意的臨床修復(fù)效果,大大改善了牙列缺損或缺失患者的生活質(zhì)量,成為了牙列缺損和牙列缺失的首選治療方案。 種植體的功能特征主要體現(xiàn)在種植體與骨之間的接觸界面。良好的種植體表面特征對(duì)骨結(jié)合的發(fā)生和形成起著至關(guān)重要的作用。Davies JE[3]的研究結(jié)果顯示,種植體經(jīng)過(guò)表面處理后其骨引導(dǎo)性將有所提高,能更好地吸附蛋白、細(xì)胞和細(xì)胞因子,發(fā)生接觸成骨,實(shí)現(xiàn)雙向成骨的骨愈合模式,故可以有效地促進(jìn)骨結(jié)合。與傳統(tǒng)的光滑機(jī)械加工表面相比,具有合適粗糙度的純鈦種植體表面將有利于成骨細(xì)胞的粘附、增殖、分化和礦化。各國(guó)學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了大量的研究,其研究結(jié)果與本課題組的前期研究結(jié)果相似,同樣顯示了種植體的表面理化特征和生物學(xué)特性不僅可以決定骨組織細(xì)胞的附著、增殖和分化,而且在很大程度上決定了種植體與骨界面的愈合速率。因此,通過(guò)對(duì)鈦種植體進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋砻嫣幚?可以提高材料的理化特性、生物活性和骨引導(dǎo)性,甚至可以使其獲得骨誘導(dǎo)性,從而達(dá)到促進(jìn)骨結(jié)合、縮短臨床愈合時(shí)間和種植體長(zhǎng)度以及維持功能負(fù)重后的長(zhǎng)期穩(wěn)定性等良好效果。 目前,種植體的表面粗化處理方法主要有：1.表面加成法：鈦漿噴涂(Titanium plasma spray, TPS)涂層、羥基磷灰石(HA)涂層等；2.表面減去法：噴砂結(jié)合酸蝕(Sandblasting with large grit and acid-etching, SLA)、雙重酸蝕、電子束熱處理、激光處理等；3.表面氧化法：陽(yáng)極氧化(Anodic oxidation, AO)、微弧氧化(Micro-arc Oxidation, MAO)等[12-14]。這些方法都在表面形貌、元素組成、分子結(jié)構(gòu)、電荷狀態(tài)、表面自由能、親疏水性特性等方面進(jìn)行了不同程度上的改性,從而改變了種植體表面的生物學(xué)特性,進(jìn)而影響到種植體與宿主之間復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。例如現(xiàn)今流行的SLA表面處理技術(shù),在大顆粒噴砂獲得10-30μm孔洞并形成一級(jí)粗糙度的基礎(chǔ)上,加以混合酸高溫酸蝕來(lái)添加1～3μm微孔形成二級(jí)粗糙度,一級(jí)粗糙度類似于骨陷窩有利于成骨細(xì)胞的附著,二級(jí)粗糙度可以刺激成骨細(xì)胞增殖分化,故這種多級(jí)立體表面形貌有利于骨結(jié)合的形成,并在體外測(cè)試中獲得良好的扭矩值[15-18]。由此可見(jiàn),粗化表面處理是經(jīng)臨床證實(shí)的有效表面處理方式,其可以使得種植體表面獲得良好的形態(tài)學(xué)特性。 但是,傳統(tǒng)的SLA表面在制備完成后被置于空氣中干燥,從而使得表面成為疏水性。疏水性表面將會(huì)阻礙液體在表面鋪展,而親水性表面則很容易被液體潤(rùn)濕,并同時(shí)可以增強(qiáng)與周圍生物環(huán)境的反應(yīng),如增加蛋白的吸附和成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為[19-21]。因而,需要對(duì)SLA表面進(jìn)行進(jìn)一步的改良。在保持SLA表面的良好三維多級(jí)孔洞形態(tài)特征的基礎(chǔ)上,噴砂酸蝕純鈦表面完成后被保存在液體中,避免了空氣中碳?xì)浠衔锏奈廴?從而獲得了親水性的改良SLA(modified SLA, modSLA)表面,經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明,該表面可以促進(jìn)成骨基因的表達(dá)、成骨細(xì)胞的分化和礦化以及早期骨結(jié)合[22-25]。 因此,在保持種植體這種良好的宏觀粗化表面的基礎(chǔ)上,需要再進(jìn)一步對(duì)種植體表面進(jìn)行活化處理,微觀修飾則是追求最大化的優(yōu)化種植體生物學(xué)活性的重要手段。其中,作為種植體表面重要特征的表面自由能(Surface free energy,SFE)則是粗化表面微觀修飾的重要研究方向和內(nèi)容。 在相同表面形態(tài)下,具有不同SFE的材料表面可以表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)不同SFE表面的生物學(xué)特性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。Textor等提出,與水相似的清潔且親水的二氧化鈦表面是由二氧化鈦的羥化或水化并且被水高度潤(rùn)濕造成的,這使得該表面可以與含有蛋白等活性分子的水層進(jìn)行合適的相互作用。NygrenH[29]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與全血接觸的過(guò)程中,高SFE的親水性表面粘附了更高濃度的補(bǔ)體C1、凝血酶、凝血酶原,血小板較少；而低SFE的疏水性表面則粘附有較多的纖維蛋白原和血小板。而Pesskova[30]的研究中,表面能中的極性成分將影響到蛋白和細(xì)胞的反應(yīng),其中極性成分高的表面,具有較高的細(xì)胞密度和較低的炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)物,但沒(méi)有纖維形成,而具有較低極性成分的表面則具有較高的炎癥介質(zhì)表達(dá)和較低細(xì)胞增殖,但在凝血中有較快的纖維形成。Hallab[31]的研究顯示細(xì)胞在金屬材料上的粘附率與材料的SFE成正比。Zhao[27,32]等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為,高SFE的Ti02表面可以使成骨細(xì)胞表達(dá)更高的ALP和OC活性,生產(chǎn)更多的PGE2和TGF-β1,并且發(fā)現(xiàn)純鈦表面的SFE與大氣中碳?xì)浠衔锵嚓P(guān)。因此,有效提高種植體表面的SFE,獲得親水性粗糙表面,將更利于成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為以及骨結(jié)合的發(fā)生、形成以及長(zhǎng)期的穩(wěn)定。 SFE的大小取決于材料表面形態(tài)結(jié)構(gòu)、元素組成、電荷狀態(tài)等。實(shí)驗(yàn)證實(shí),不同的表面處理方法在改變材料表面形態(tài)結(jié)構(gòu)、元素組成、電荷特征的同時(shí),也會(huì)導(dǎo)致SFE發(fā)生變化。碳?xì)浠衔镂廴究梢允沟眉冣丼FE和親水性下降,甚至疏水,而酸蝕、堿熱處理、光化學(xué)催化、羥基化等處理方法則可以增加SFE和親水性,甚至形成超親水性表面。其中,光化學(xué)催化反應(yīng)是改性半導(dǎo)體材料,提高其SFE并獲得超親水特性的一種簡(jiǎn)單、方便和高效的方法。 光催化反應(yīng),又稱“本多-藤島反應(yīng)”,是日本的本多健一和藤島昭兩位學(xué)者發(fā)現(xiàn)的。該反應(yīng)的光化學(xué)催化劑大多是硫族化合物半導(dǎo)體(目前以TiO2使用最為廣泛),其都具有區(qū)別于金屬或絕緣物質(zhì)的特別能帶結(jié)構(gòu),即在價(jià)帶(ValenceBand, VB)和導(dǎo)帶(Conduction Band, CB)之間存在一個(gè)禁帶(Forbidden Band,FB)。由于半導(dǎo)體的光吸收閾值與帶隙具有以下的關(guān)系,K=1240/Eg(eV),因此,常用的寬帶隙半導(dǎo)體的吸收波長(zhǎng)閾值大都在紫外區(qū)域。當(dāng)光子能量高于半導(dǎo)體吸收閾值的光照射半導(dǎo)體時(shí),半導(dǎo)體的價(jià)帶電子發(fā)生帶間躍遷,即從價(jià)帶躍遷到導(dǎo)帶,從而產(chǎn)生光生電子(e-)和空穴(h+)。此時(shí),吸附在催化劑表面的溶解氧俘獲電子形成超氧負(fù)離子,而空穴將吸附在催化劑表面的氫氧根離子和水氧化成氫氧自由基。而超氧負(fù)離子和氫氧自由基具有很強(qiáng)的氧化性,能將絕大多數(shù)的有機(jī)物氧化至最終產(chǎn)物C02和H20,甚至對(duì)一些無(wú)機(jī)物也能徹底分解。當(dāng)光照結(jié)束時(shí),光生電子將在瞬間復(fù)位到空穴中,并在材料表面留下大量的親水性基團(tuán)-OH,從而在降低材料表面碳?xì)浠衔镂廴镜耐瑫r(shí),最終使其獲得了超親生特性。 近期,紫外線(Ultraviolet, UV)輻照被應(yīng)用于種植體表面處理以獲得超親水特性。研究顯示,與單一的表面處理技術(shù)相比,純鈦表面附加UV輻照后顯示出更佳的生物活性[33-37]。另外,相關(guān)的實(shí)驗(yàn)表面,由于碳?xì)浠衔镂廴镜脑黾?純鈦酸蝕表面的生物活性將隨著時(shí)間的遷移而發(fā)生老化[38]。有趣的是,那些由于長(zhǎng)時(shí)間存放而老化的種植體在受到UV輻照后,其表面活性得以復(fù)活,并同時(shí)獲得親水特性,促進(jìn)了蛋白吸附、成骨細(xì)胞粘附、增殖、分化和礦化,甚至骨結(jié)合,顯示出良好的生物活性[39-42]。但是,至今為止,國(guó)內(nèi)外仍然缺乏關(guān)于純鈦SLA表面復(fù)合UV輻照處理的相關(guān)研究,對(duì)純鈦UV-SLA表面進(jìn)行科學(xué)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試,將可以更好地探討SLA處理和UV輻照這兩種表面改性技術(shù)的有機(jī)結(jié)合,能否在保留噴砂酸蝕良好形貌特征的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化材料的生物活性,以最終提高種植體表面的生物活性,促進(jìn)骨結(jié)合的形成。 因此,本研究將對(duì)SLA、modSLA和UV-SLA三種表面進(jìn)行比較,通過(guò)表面理化性能分析、MG63成骨細(xì)胞體外生物活性檢測(cè)以及模擬體液(Stimulated body fluid, SBF)體外礦化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)UV-SLA表面的生物活性,以為純鈦種植體表面復(fù)合UV輻照技術(shù)的實(shí)現(xiàn)提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 1.實(shí)驗(yàn)樣品的制備：通過(guò)嚴(yán)格選擇和控制表面處理過(guò)程中的各種參數(shù),結(jié)合噴砂、酸蝕、水體保存、UV輻照等技術(shù),制備出相對(duì)一致、重復(fù)性可、具有特征性的多級(jí)孔洞形貌及適中粗糙度的SLA、modSLA和UV-SLA表面。 2.理化性能的檢測(cè)：通過(guò)掃描電子顯微鏡、光學(xué)干涉輪廓儀、X線光電子能譜儀和接觸角測(cè)量?jī)x分別對(duì)SLA、modSLA和UV-SLA表面的形貌特征、粗糙度、元素成分以及潤(rùn)濕性進(jìn)行檢測(cè),以其評(píng)估不同處理組表面的理化性能特性。 3.MG63成骨細(xì)胞體外生物活性檢測(cè)：通過(guò)MG63成骨細(xì)胞培養(yǎng),掃描電子顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察,細(xì)胞粘附率、增殖率、分化以及礦化測(cè)試,來(lái)檢測(cè)MG63成骨細(xì)胞在SLA、modSLA和UV-SLA表面上的生長(zhǎng)形態(tài)、粘附率、增值率、分化以及礦化的情況,以評(píng)估不同處理組樣品表面的體外細(xì)胞生物活性。 4.SBF體外礦化誘導(dǎo)能力檢測(cè)：通過(guò)對(duì)SLA、modSLA和UV-SLA表面在SBF中浸泡誘導(dǎo)1w、2w、3w和4w后沉積礦化物的質(zhì)量、形態(tài)、成分和晶相的檢測(cè),來(lái)評(píng)估不同處理組樣品表面的體外礦化誘導(dǎo)能力。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來(lái)表示。樣本量n=3。應(yīng)用SPSS v13.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后,以析因設(shè)計(jì)方差分析來(lái)檢測(cè)處理因素的主效應(yīng)、交互作用,再分別使用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Bonferroni檢驗(yàn)或兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行整體和組間的比較。當(dāng)正態(tài)分布但方差不齊時(shí),則分別使用Welch檢驗(yàn)和Dunnet's T3檢驗(yàn)或兩獨(dú)立樣本t'檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行整體和組間的比較。當(dāng)非正態(tài)分布和／或方差不齊時(shí),則分別應(yīng)用Kruskal-Wallis H非參數(shù)檢驗(yàn)和Nemenyi多重比較來(lái)分析數(shù)據(jù)的整體和組間差異。假設(shè)檢驗(yàn)為雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。當(dāng)P0.05時(shí),差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)P0.01時(shí),差異被認(rèn)為具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.通過(guò)嚴(yán)格選擇和控制表面處理過(guò)程中的各種參數(shù),制備出相對(duì)一致、重復(fù)性可、大小與外觀均與預(yù)期設(shè)計(jì)相符的粗糙SLA、modSLA和UV-SLA表面。 2.理化性能分析顯示,SLA、modSLA和UV-SLA表面均具有相似的三維立體多級(jí)孔洞形貌10-30μm的大孔和1-3μm的微孔)和中等粗糙度(Sa約為2.43μm)。但其碳?xì)浠衔锖俊?rùn)濕性以及SFE存在差異。與低SFE(23.16mN/m).且疏水的SLA表面(32.01%At C)相比,modSLA表面(25.31%At C)和UV-SLA表面(14.26%At C)皆具有親水性和高SFE(74.06mN/m),而且UV-SLA表面獲得了大量的親水性基團(tuán)-OH(60.90%At O)。 3.MG63成骨細(xì)胞體外生物活性檢測(cè)顯示,MG63成骨細(xì)胞在各組樣品表面的生長(zhǎng)形態(tài)良好。與疏水性SLA表面相比,親水性nodSLA表面更能顯著地增強(qiáng)MG63成骨細(xì)胞在樣品表面14d的礦化(P0.01)。而超親水性UV-SLA表面,則最大程度地促進(jìn)了MG63成骨細(xì)胞的粘附(24h)、增殖(7d)、分化(14d)和礦化(14d),與其他兩組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05or P0.01)。 4.體外礦化誘導(dǎo)能力檢測(cè)顯示,UV-SLA表面在礦化誘導(dǎo)3w時(shí),其沉積礦化物的質(zhì)量要高于1modSLA和SLA表面(P0.05),到4w時(shí),UV-SLA和modSLA表面沉積的礦化物大量增加,具有較高的鈣磷比,并覆蓋了整個(gè)樣品表面,分別達(dá)到3.23±0.35mg和2.13±0.95mg,約為SLA表面(0.43±0.15mg)的8倍和5倍,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。XRD分析礦化沉積物的成分為磷灰石。結(jié)論 碳?xì)浠衔镂廴臼怯绊懭斯げ牧仙锘钚缘囊粋�(gè)重要因素。dH20保存可以有效地維持粗糙表面的生物活性,而UV輻照處理則是一種在不改變表面形貌和粗糙度的基礎(chǔ)上,有效地分解碳?xì)浠衔镂廴?并增強(qiáng)噴砂酸蝕純鈦表面生物活性的良好表面處理技術(shù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R783.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2501177