【摘要】：組織工程研究的主要目的是利用活細(xì)胞和生物材料,體外培養(yǎng)或者構(gòu)建組織和器官,以修復(fù)或替代損傷的組織或器官。種子細(xì)胞是實現(xiàn)組織重建的前提和基礎(chǔ),利用微載體培養(yǎng)技術(shù)對組織工程種子細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增,是現(xiàn)如今最常用、最有效的方法。目前,大多數(shù)微載體材料仍是聚合物,制備新型的生物性能優(yōu)良的微載體材料仍是組織工程與再生醫(yī)學(xué)比較重要的問題。羥基磷灰石(HA)具有優(yōu)良的生物活性和生物相容性,被認(rèn)為是一種潛在的細(xì)胞培養(yǎng)微載體材料。然而,因HA的理論密度較高限制了其作為微載體材料的應(yīng)用。對HA復(fù)合高分子類材料的微載體已有研究,但是HA復(fù)合無機(jī)材料作為細(xì)胞培養(yǎng)微載體的相關(guān)研究還很少�？招牟Ａ⑶�(HGM)以其良好的物理化學(xué)性質(zhì)被廣泛地開發(fā)利用,在其表面涂覆不同性質(zhì)的涂層,可使其具有不同的功能特性。 本研究針對HGM的物理化學(xué)性質(zhì),選擇NaOH, Ca(OH)2和Piranha溶液三種不同的表面處理方式對其進(jìn)行表面活化,通過簡易的仿生沉積的方法在其表面沉積了HA涂層,制備出了HA-HGM復(fù)合空心微球。同時,對三種不同表面處理方式的機(jī)理進(jìn)行了討論,優(yōu)化了每種處理方式的工藝參數(shù),并對其結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行表征,確定了合適的表面處理方式。通過調(diào)整沉積時間、模擬體液(SBF)的濃度、液固比等參數(shù),分別利用X射線衍射儀(XRD)、紅外光譜分析儀(FTIR)、場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)、比表面積分析儀(SSA)、高分辨透射電鏡(HRTEM)、X射線光電子能譜儀(XPS)、掃描探針顯微鏡(SPM)等手段對涂層的相組成、原子團(tuán)、形貌、比表面積、微觀結(jié)構(gòu)、表面成分以及表面粗糙度進(jìn)行了系統(tǒng)的分析,優(yōu)化出沉積工藝,并探索了煅燒對HA涂層微觀結(jié)構(gòu)和性能的影響。在此基礎(chǔ)上,選取了兩種HA-HGM復(fù)合空心微球,對MC3T3成骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),通過MTT法檢測了細(xì)胞的增殖率,并檢測了堿性磷酸酶(ALP)活性和細(xì)胞分泌蛋白的功能,初步研究了HA-HGM復(fù)合空心微球作為成骨細(xì)胞培養(yǎng)微載體的性能。 結(jié)果表明,HGM主要組成成分是Si02和A1203,呈中空灰白色的規(guī)則球形,表面光滑,主要由短棒狀的晶體和非晶玻璃體組成。三種表面處理方式均可激發(fā)HGM的化學(xué)活性,激發(fā)的機(jī)理有所不同,但是關(guān)鍵還是使Si-O鍵和Al-O鍵斷裂,破壞其Si-O-Si或Si-O-A1網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過三種方式不同表面處理后,利用仿生沉積法均可在HGM表面沉積碳酸化的HA。通過分析HA涂層的結(jié)構(gòu)和性能,以操作簡便易行和無危險性為原則,選擇最優(yōu)的表面處理方式是HGM在1mol/L NaOH溶液中于36.5℃下處理2h。 沉積時間、SBF的濃度以及液固比等條件對沉積層HA的結(jié)構(gòu)和性能有明顯的影響。隨著沉積時間的延長,HA涂層的厚度不斷增加,沉積速度約為0.14μm/dayo沉積時間延長到15天后,沉積層的生長速度變得緩慢,浸泡18天后生長進(jìn)入平臺期。這主要是由于沉積層厚度增加,使得作為HA的形核點(diǎn)的富硅層溶解出的速度降低引起的。同時,浸泡時間為15天時,涂層表面部分出現(xiàn)微裂紋,而且隨浸泡時間的繼續(xù)延長,微裂紋增加,甚至使涂層從HGM表面脫落。在低濃度的SBF溶液中,HGM表面不能沉積HA涂層,只有在1.5倍以上濃度的SBF溶液中才能順利沉積HA涂層。SBF濃度增大對沉積層生長速度的影響并不明顯。液固比也是影響沉積層性能的一個重要因素,研究表明,在1.5SBF溶液中,只有液固比在高于150：1以上才能沉積HA涂層。在本研究條件下,合適的工藝參數(shù)是無生物玻璃活化,1.5SBF,液固比150：1,沉積時間15天。 仿生沉積的HA涂層表面以片狀的結(jié)構(gòu)相互交錯,彎曲排列而成,形成花瓣狀。涂層的結(jié)晶度不高,并且是含有碳酸根的類骨磷灰石,厚度約為2μm,孔徑大小約為100nm,可以促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的響應(yīng),有利于細(xì)胞的黏附與增殖和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞功能。HA沉積層由近基體的致密層和近表面的多孔疏松層的雙層結(jié)構(gòu)組成。 在500-800℃之間對微球進(jìn)行煅燒處理,總體上隨煅燒溫度升高,HA涂層的比表面積迅速降低,孔徑尺寸不斷增大,花瓣狀多孔形貌消失,逐漸由納米顆粒代替。煅燒溫度為600℃時,總孔體積最大(0.0359ml／g),孔分布均勻。這主要是因為煅燒過程中碳酸根不斷從HA涂層晶體中釋放出來,同時,多孔花瓣狀結(jié)構(gòu)變成均勻的納米顆粒組成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。煅燒溫度升高到700℃時,沉積層內(nèi)晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化生成磷酸三鈣(TCP)。HRTEM結(jié)果表明,沉積層HA中含有少量的非晶,片狀結(jié)構(gòu)存在于整個涂層中。經(jīng)過煅燒處理后,組成HA的顆粒成棒狀結(jié)構(gòu),結(jié)晶度升高,表面粗糙度先降低后升高。 選取未煅燒(HA-w)和600℃(HA-600)煅燒30min的HA-HGM復(fù)合空心微球為研究對象,以MC3T3成骨細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞,研究了復(fù)合微球?qū)Τ晒羌?xì)胞培養(yǎng)的能力。研究表明,對MC3T3培養(yǎng)24h后,成骨細(xì)胞能較好的在空心微球表面進(jìn)行黏附和鋪展。煅燒后的樣品,因HA涂層與基體HGM結(jié)合強(qiáng)度降低,使得在細(xì)胞培養(yǎng)過程中部分涂層發(fā)生脫落現(xiàn)象,對細(xì)胞培養(yǎng)和形貌觀察造成了不利影響。而且發(fā)現(xiàn),成骨細(xì)胞在HGM基體上呈現(xiàn)薄膜狀態(tài),無細(xì)胞核存在,這說明HGM本身不利于成骨細(xì)胞的生長。 HA-HGM復(fù)合空心微球表面具有良好的生物相容性和活性,同時,在培養(yǎng)板中又增加了培養(yǎng)的面積。因此,MTT試驗表明成骨細(xì)胞在HA-w微球存在下的增殖率高于空白對照組的增殖率。成骨細(xì)胞功能檢測也表明,實驗組ALP的活性要高于空白對照組。試驗表明,HGM表面仿生沉積HA涂層所得到的HA-HGM復(fù)合空心微球適用于成骨細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

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