【摘要】：研究背景骨缺損的有效解決辦法--組織工程學(xué)在骨科領(lǐng)域,由于外傷、骨腫瘤、骨壞死等原因,導(dǎo)致不同程度的骨缺損,在臨床上非常常見,由于植骨來源的限制,尤其是大段骨缺損,在治療上仍然是一大難題。組織工程學(xué)的發(fā)展為骨缺損的治療提供了一個新的突破點。而尋找增殖和分化能力強、來源充足的干細胞,具備較強地誘導(dǎo)并促進增殖和分化的成骨因子以及最佳的新支架材料,達到最佳的骨缺損修復(fù)效果是骨科領(lǐng)域不斷深入研究的熱點。骨的形成是由成骨干細胞、成骨的環(huán)境支架以及調(diào)節(jié)成骨的因子三個要素共同作用的結(jié)果。獲取穩(wěn)定的、可誘導(dǎo)分化成骨細胞的成骨前體細胞(種子細胞)至關(guān)重要。胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)系的建立為人類探索干細胞生物學(xué)調(diào)控機理和評價其治療許多疾病的潛能打開了方便之門,但胚胎干細胞的研究面臨許多社會倫理問題。目前研究較多的是骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs),曾被認為是骨組織工程中最佳的細胞來源。然而,在臨床應(yīng)用過程中,自體骨髓干細胞治療需要從患者身上獲得大量的細胞,這是一個侵害性的過程,且一次最多可抽取到40ml的骨髓,約1.2×109個有核細胞,量偏少,使其應(yīng)用受到了很大限制。脂肪干細胞(adipose-derived stem ells,ADSCs)近年來研究證實,在脂肪組織中能分離和培養(yǎng)出脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs),與MSCs類似,來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層,可以向成軟骨細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞和脂肪細胞等不同胚層來源的細胞分化,具備自我更新能力與多向分化潛能,兼有骨髓間充質(zhì)干細胞等特性。局麻條件下,通過真空抽脂術(shù),成人一次可獲取200ml的脂肪組織,獲得約1×106個ADSCs,約是40ml骨髓中BMSCs的40倍。ADSCs由于取材容易,創(chuàng)傷小,含量高,增值能力好,無免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)勢,且可來自自體細胞,不存在倫理學(xué)的爭議,是一種較理想的組織工程種子細胞。有研究表明,ADSCs體外條件下容易導(dǎo)入外源基因,可作為基因治療的目的基因載體。骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(Bone morphogenetic protein-9,BMP-9骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是轉(zhuǎn)化生長因子beta超家族(Transforming growth factor-beta, TGF-P)的成員之一,結(jié)構(gòu)類似且高度保守,能夠有效誘導(dǎo)體內(nèi)和體外實驗中成骨分化。Kang等的研究證實BMP9是體內(nèi)外誘導(dǎo)MSCs成骨分化功能最強的成員之一其誘導(dǎo)成骨作用強于傳統(tǒng)應(yīng)用的BMP2、6、7,是一種重要的成骨細胞分化調(diào)節(jié)因子。該研究結(jié)果為促進間充質(zhì)干細胞成骨分化,構(gòu)建具有基因強化成骨活性的組織工程骨找到了有顯著意義的突破點。淫羊藿苷(Icariin, ICA)近年來,我國研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥成分淫羊藿苷對摘除卵巢所致大鼠骨質(zhì)疏松癥有良好的防治作用,而且能夠促進體外培養(yǎng)的BMSCs的增殖及成骨分化。且淫羊藿苷提取工藝簡單,來源廣泛,費用較低,對促進骨缺損修復(fù)是一種很有應(yīng)用前景的中藥單體。近年來的研究成果肯定了淫羊藿能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞成骨分化,可用于骨組織工程中促進骨缺損的修復(fù)。載體支架材料—納米晶膠原基人工骨(Nano-hydroxyapatite/collagen, nHAC)目前國內(nèi)外人工骨修復(fù)支架材料的研究熱點是模仿天然骨的成分結(jié)構(gòu)特性及礦化過程,研制仿生人工骨修復(fù)材料。納米晶膠原基骨(nHAC)是清華大學(xué)材料系根據(jù)仿生原理制備而成的納米骨復(fù)合材料。2005年4月獲得批準(zhǔn)上市,成為國內(nèi)首個可以在市場上公開銷售和應(yīng)用的納米醫(yī)藥產(chǎn)品。在微結(jié)構(gòu)和成分兩方面都與天然骨有相似性,材料的孔隙結(jié)構(gòu)與松質(zhì)骨相同,分級結(jié)構(gòu)與天然骨相同,是良好的細胞載體,能夠為細胞的生長、增殖分化提供良好的微環(huán)境。nHAC骨修復(fù)材料已經(jīng)在動物實驗、臨床上修復(fù)骨缺損方面有良好的表現(xiàn)�；谏鲜�,本項目開展了以下研究：①將BMP-9基因轉(zhuǎn)染脂肪干細胞,使組織局部持續(xù)表達BMP-9；②復(fù)合淫羊藿苷與nHAC組裝成三維緩釋支架,使修復(fù)局部持續(xù)緩釋細胞的誘導(dǎo)和營養(yǎng)物質(zhì)--淫羊藿苷；③并將此緩釋支架作為自體脂肪干細胞(ASCs)的載體,然后將制成的細胞支架復(fù)合體(轉(zhuǎn)染了BMP-9的ADSCs+攜淫羊藿苷的nHAC支架復(fù)合體)置于體內(nèi),治療兔大段橈骨缺損。研究包括體外、體內(nèi)兩方面實驗,分別在細胞和動物水平上進行。觀察BMP-9及淫羊藿苷誘導(dǎo)ADSCs的成骨效能。為治療骨缺損進一步研究提供理論和實驗依據(jù)。目的1.建立一種簡單高效的兔脂肪干細胞的體外分離、培養(yǎng)、傳代方法,證實其多向、尤其是骨向分化潛能。2.載hBMP-9的腺病毒(Ad-hBMP-9)轉(zhuǎn)染脂肪干細胞,為ADSCs持續(xù)、高效、穩(wěn)定表達BMP-9及后續(xù)的體內(nèi)成骨實驗提供基礎(chǔ)。3.進一步探討ADSCs體內(nèi)成骨的效率：BMP-9修飾的同種異體脂肪干細胞復(fù)合攜淫羊藿苷支架材料(nHAC)修復(fù)兔大段橈骨缺損。方法1. ADSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定：新西蘭大白兔麻醉后在無菌條件下分離兔腹股溝皮下脂肪組織,剪碎成脂肪顆粒后采用0.1%I型膠原酶37℃恒溫條件下震蕩消化,用含10%胎牛血清(F B S)及1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)在細胞培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)、擴增、純化和傳代兔ADSCs,并對其細胞的形態(tài)、體外增殖能力進行觀察統(tǒng)計,繪制細胞生長曲線,并對其經(jīng)過誘導(dǎo),對其成骨、成脂肪、成軟骨能力的分化及表面標(biāo)記抗原的表達進行分析鑒定研究。2.以腺病毒為載體,Ad-hBMP-9轉(zhuǎn)染脂肪干細胞的實驗：載BMP-9的腺病毒直接感染P3代的ADSCS。相差顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果、細胞的生長形態(tài)；MTT法檢測Ad-hBMP-9轉(zhuǎn)染ADSCs增殖情況,繪制ADSCs生長曲線；RT-PCR檢測目的基因BMP-9 mRNA的表達；堿性磷酸酶染色檢測ADSCs的成骨情況。3.建立兔橈骨15mm缺損模型,實驗分成7組,每組各8只,共56只。按照分組：A組：ADSCs+支架+BMP-9+淫羊藿苷；B組：ADSCs+支架+BMP-9;C組：ADSCs+支架+淫羊藿苷；D組：ADSCs+支架；E組：支架+淫羊藿苷；F組：支架；G組：空白對照(注：BMP-9是轉(zhuǎn)染至ADSCs內(nèi)持續(xù)表達起作用的)。分別于術(shù)后30天、60天、90天、109天在兔麻醉下行實驗橈骨的X線檢測、并根據(jù)Lane-Sandhu X線評分法進行x線片評分。于術(shù)后第60天、109天分兩批處死實驗兔,取出橈骨行缺損處骨修復(fù)情況的大體觀察、生物力學(xué)測定以及組織學(xué)觀察、并利用計算機圖像分析系統(tǒng)對組織學(xué)切片行半定量檢測分析分析骨缺損處成骨面積比例,探討體內(nèi)成骨的效率。結(jié)果1. ADSCs的分離、培養(yǎng)、分化及鑒定：通過膠原酶消化+貼壁培養(yǎng)法,體外成功地從脂肪組織中分離、培養(yǎng)出大量的成纖維細胞樣外觀的兔脂肪干細胞(ADSCs),具有良好的細胞形態(tài)(呈梭形或多角狀,類似成纖維細胞,團簇狀生長)和極強的增殖能力。經(jīng)體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化,ADSCs具有成骨、成軟骨及成脂分化潛能。兔第三代ADSCs表面標(biāo)記CD34、CD105陽性,Sca-1高表達,不表達CD45及SSEA-1,具有干細胞的表面分子的特征。2.BMP-9轉(zhuǎn)染ADSCs的實驗：(1)載BMP-9基因的腺病毒可成功轉(zhuǎn)染ADSCs.(2)熒光顯微鏡觀察,病毒感染的ADSCs,細胞核和細胞質(zhì)都顯示綠色熒光,各細胞熒光強弱不等。轉(zhuǎn)染后24 h已經(jīng)有較多量的綠色熒光出現(xiàn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染后24小時的EGFP表達率統(tǒng)計Ad-hBMP9轉(zhuǎn)染ADSCs的轉(zhuǎn)染效率為30.6士4.2%。48～72 h,熒光明顯增多、增強。7d后,轉(zhuǎn)染率高達80%以上,細胞呈團聚狀生長,細胞體積增大,部分細胞形態(tài)呈橢圓形。未感染病毒的ADSCs熒光顯微鏡下無綠色熒光出現(xiàn)。(3)Ad-hBMP9轉(zhuǎn)染ADSCs后的生長曲線與正常培養(yǎng)的ADSCs的生長曲線基本一致。(4)RT-PCR檢測結(jié)果顯示,各轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)hBMP-9的mRNA持續(xù)陽性表達,未轉(zhuǎn)染組未見陽性條帶。(5)ADSCs轉(zhuǎn)染后,ALP染色為陽性,轉(zhuǎn)染Ad-hBMP9后第7d,ALP染色顯示黑色細胞數(shù)目多,細胞胞漿內(nèi)有黑色顆粒,顆粒較大,染色更深。未轉(zhuǎn)染組：細胞內(nèi)偶見少量黑色顆粒,染色較淡。3.動物體內(nèi)實驗：(1)X線檢查：A組：術(shù)后30天植入?yún)^(qū)有骨痂形成；60天骨痂與斷端宿主骨間界限模糊,骨痂密度不均勻,皮質(zhì)骨輪廓出現(xiàn),骨缺損已基本消失,有典型的骨愈合影像；90天骨痂已經(jīng)塑形,新生骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰,與斷端骨自然連接,髓腔基本再通,109天髓腔完全再通。支架材料已經(jīng)基本降解。B組：60天缺損區(qū)有少量骨痂生成,骨缺損處可見有云霧狀高密度影,缺損區(qū)依然存在。109天骨痂已經(jīng)塑形,與斷端骨自然連接,髓腔基本再通,支架材料大部降解。C組：109天骨缺損區(qū)表現(xiàn)為較多骨痂生成影像,斷端連接,但仍然有缺損,髓腔未通,支架材料基本降解。D組、E組：90天缺損區(qū)有少量骨痂生成,骨缺損處可見有云霧狀高密度影,缺損區(qū)依然存在。109天骨痂有所增多,骨斷端連續(xù)性仍未建立。F組：109天缺損區(qū)有少量骨痂生成,少量云霧狀高密度影,支架材料大部已經(jīng)降解。G組：109天骨斷端已完全硬化,橈骨斷端間無任何連接,呈現(xiàn)骨不連表現(xiàn)。此外,骨缺損愈合的Lane-Sandhu X線評分顯示,A組評分顯著高于其他組,B、C兩組也明顯好于D、E、F、G組(P0.05)。(2)組織學(xué)檢查：術(shù)后第60天A組骨缺損處可見在支架材料的孔內(nèi)有較多小梁骨形成,新生小梁骨內(nèi)可見骨細胞散在分布于骨基質(zhì)中。而小梁骨的周圍有正在形成的新生骨組織,可見到骨陷窩散在其中,并觀察到正在降解的團塊狀的支架材料。B組的骨缺損處可見在支架材料的大部分微孔內(nèi)有小梁骨形成,骨細胞散在分布于新生小梁骨內(nèi)的骨基質(zhì)中。術(shù)后109天,A組于骨缺損處大量生成小梁骨,小梁骨之間有骨髓樣組織,形成髓腔,髓腔通暢。B組見較多小梁骨形成,其周邊可見大量正形成的新生的骨組織,髓腔部分通暢。在術(shù)后60天、109天,C組骨缺損處理也見新生骨組織形成。D、E、F組則有少量新骨增生、散在類骨質(zhì)形成。在整個觀察期間,G組未見有任何成骨現(xiàn)象、斷端封閉。此外,組織學(xué)切片半定量檢測結(jié)果分析各實驗組骨缺損處成骨面積比例：術(shù)后第60天、109天A組成骨面積比例均顯著高于其他組,B、C組優(yōu)于D、E、F組。其余組對G組(空白對照組)均有顯著性差異。(P0.05,n=4)(3)生物力學(xué)測定：術(shù)后第109天取出的實驗橈骨(n=4)行生物力學(xué)測定結(jié)果顯示：A組的抗折斷力顯著高于其他組,B、C兩組也明顯好于D、E、F、G組(P0.05)。結(jié)論1.通過膠原酶消化+貼壁培養(yǎng)法,體外成功地從脂肪組織中分離、培養(yǎng)出大量的成纖維細胞樣外觀的兔脂肪干細胞(ADSCs)。體外培養(yǎng)的兔ADSCs具有純度高,形態(tài)均勻,穩(wěn)定性較好,易于增殖擴增等特點。2.本實驗分離、培養(yǎng)的兔ADSCs具有干細胞的表面分子的特征。3.實驗證實,重組腺病毒介導(dǎo)的hBMP-9基因體外轉(zhuǎn)染脂肪干細胞具有較安全、轉(zhuǎn)染效率高的特點,轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-9的脂肪干細胞能有效表達BMP-9 mRNA。重組腺病毒是一種理想的基因載體。4.轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-9后,ADSCs能夠成功地持續(xù)表達BMP-9。5. Ad-hBMP-9轉(zhuǎn)染脂肪干細胞后,細胞依然保持較旺盛的增殖能力,且細胞轉(zhuǎn)化為具有成骨能力的細胞。被轉(zhuǎn)染后的hBMP-9基因成功地誘導(dǎo)了ADSCs向成骨細胞分化。6.本研究證實,將BMP-9轉(zhuǎn)染的ADSCs復(fù)合攜淫羊藿苷的nHAC支架材料植入兔橈骨15mm節(jié)段性骨缺損中,于術(shù)后第30天、60天、90天、109天影像學(xué)檢查,術(shù)后第90天、109天的組織學(xué)、生物力學(xué)等證實骨缺損完成修復(fù),構(gòu)建的這種組織工程骨有效促進了骨再生,提高了骨缺損的修復(fù)效果,為骨組織工程種子細胞的選擇以及組織工程骨復(fù)合體的構(gòu)建、設(shè)計提供了一種新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R687;R318.08

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本文編號：2414916