【摘要】：第一部分單抗CD44-生物素-親和素綁定技術(shù)提高軟骨細胞與殼聚糖無孔膜黏附力的實驗研究 目的：考察單抗CD44-生物素(Biotin)-親和素(Avidin)綁定技術(shù)(CBA技術(shù))能否在構(gòu)建的軟骨細胞二維培養(yǎng)體系中提高軟骨細胞與殼聚糖無孔膜表面的黏附能力。 方法：軟骨細胞分離培養(yǎng)及鑒定,制備殼聚糖無孔膜。制備軟骨細胞二維培養(yǎng)體系,分3組：A.殼聚糖無孔膜+軟骨細胞(常規(guī)組)；B.生物素+親和素化殼聚糖無孔膜+軟骨細胞(BA技術(shù)組)；C.生物素化單抗CD44+親和素化殼聚糖無孔膜+軟骨細胞(CBA技術(shù)組)。分別在細胞種植后的1h、2h、4h、12h和24h,用相差顯微鏡對細胞的生長黏附情況進行照相分析,并利用圖像軟件對各組細胞的展平面積測定并統(tǒng)計,分析軟骨細胞對殼聚糖無孔膜表面的黏附能力。 結(jié)果：C組的大部分細胞在接種后1h就已經(jīng)張開并展平,而B組和A組細胞則分別需要2h和12h才能達到大致相同的形狀。C組細胞的展平面積明顯大于B組和A組。接種后4h,25%的C組細胞的面積達到1500-2000μm2,而B組同期只有15%,A組則要到24h后才能達到15%°各組展平面積隨時間延長遞增,各時間點平均展平面積C組B組A組,各組差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結(jié)論：Biotin-Avidin綁定技術(shù)能比常規(guī)接種方法提高軟骨細胞與殼聚糖無孔膜黏附能力,但是相比而言,單抗CD44-Biotin-Avidin綁定技術(shù)對于軟骨細胞粘附能力的提高更加顯著。 第二部分單抗CD44-生物素-親和素綁定技術(shù)提高軟骨細胞與殼聚糖三維支架黏附力及體外構(gòu)建組織工程軟骨的實驗研究 目的：觀察單抗CD44-生物素(Biotin)-親和素(Avidin)綁定技術(shù)在構(gòu)建的軟骨細胞三維培養(yǎng)體系中能否提高軟骨細胞與殼聚糖支架的黏附能力,在體外構(gòu)建的組織工程軟骨(Tissue engineering cartilage, TEC)能否促進軟骨細胞的增殖和軟骨細胞表型的表達。 方法：制備軟骨細胞三維培養(yǎng)體系,分3組：A.殼聚糖三維支架+軟骨細胞(常規(guī)組)；B.生物素+親和素化殼聚糖三維支架+軟骨細胞(BA技術(shù)組)；C.生物素化單抗CD44+親和素化殼聚糖三維支架+軟骨細胞(CBA技術(shù)組)。軟骨細胞接種后分別用細胞計數(shù)儀計數(shù)脫落細胞,測定接種細胞脫落率；MTT法生長曲線測定殼聚糖支架內(nèi)軟骨細胞增殖率；掃描電鏡觀察細胞支架復合體上細胞生長情況；生物化學檢測TEC內(nèi)的DNA和GAG含量；組織學切片觀察TEC內(nèi)軟骨細胞的增殖和胞外基質(zhì)的表達情況；RT-PCR法檢測Ⅱ型膠原(Col Ⅱ)、 aggrecan、sox9的mRNA表達。 結(jié)果：細胞接種脫落率：A組為C組的3.71倍,為B組的2.17倍,而B組為C組的1.71倍,A組B組C組(P0.05)。掃描電鏡見C組細胞數(shù)量較多,成分散狀,分布較均勻；A組細胞數(shù)量很少,成聚集狀,分布很不均勻；B組所見介于C與A組間。組織切片顯示細胞在支架內(nèi)C組增殖旺盛,胞外基質(zhì)表達較豐富；A組增殖較弱,胞外基質(zhì)表達較弱；B組介于C與A組間。DNA和GAG含量,細胞增殖率及Col Ⅱ、aggrecan、sox9的mRNA表達量表現(xiàn)為：C組B組A組(P0.05)。 結(jié)論：單抗CD44-Biotin-Avidin綁定技術(shù)能比Biotin-Avidin綁定技術(shù)更顯著的提高軟骨細胞與支架的黏附能力,并更有助于促進TEC種子細胞的增殖和軟骨細胞表型的表達。 第三部分單抗CD44-生物素-親和素綁定技術(shù)構(gòu)建組織工程軟骨修復豬膝關(guān)節(jié)負重區(qū)軟骨缺損的效果研究 目的：觀察單抗CD44-生物素(Biotin)-親和素(Avidin)綁定技術(shù),在體外構(gòu)建的組織工程軟骨移植修復豬膝關(guān)節(jié)負重區(qū)軟骨缺損的效果。 方法：如第二部分所述分3組構(gòu)建組織工程軟骨。軟骨細胞接種后測定接種細胞脫落率；Real-time PCR法檢測組織工程軟骨Ⅱ型膠原(Col Ⅱ)、 aggrecan及sox9的mRNA表達。分4組修復豬膝關(guān)節(jié)負重區(qū)軟骨全層缺損：A組植入殼聚糖支架+軟骨細胞(常規(guī)組)；B組植入BA技術(shù)構(gòu)建的組織工程軟骨(BA技術(shù)組)；C組植入CBA技術(shù)構(gòu)建的組織工程軟骨(CBA技術(shù)組)；D組植入自體軟骨(自體組)。12、24周后取出標本行大體觀察并行Moran評分；生物力學方法評估標本彈性模量和剛度；免疫印跡(Western blot)檢測新生軟骨組織內(nèi)的col Ⅱ、aggrecan目的蛋白含量；對標本行組織學HE染色、甲苯胺藍染色和免疫組織化學染色并行Wakitani組織學評分。 結(jié)果：細胞接種脫落率：A組B組C組(P0.05)；Col Ⅱ、aggrecan及sox9的mRNA表達量：C組B組A組(P0.05)；12、24周時Moran大體評分,得分越高則修復效果越好：D組C組,但無統(tǒng)計學差異(P0.05),C組B組A組(P0.05)；12、24周時生物力學檢測彈性模量和剛度、Western blot檢測colⅡ、aggrecan目的蛋白含量結(jié)果皆為：D組C組B組A組(P0.05)；組織切片顯示C、D組修復效果相似,都較好,見大量成熟軟骨細胞且基質(zhì)分布均勻,而A組修復效果較差,成熟軟骨細胞數(shù)量少且基質(zhì)分布不夠均勻,B組所見則介于A、C兩組間；12、24周時Wakitani組織學評分,得分越低則修復效果越好：D組C組,但無統(tǒng)計學差異(P0.05),C組B組A組(P0.05)。 結(jié)論：Biotin-Avidin綁定技術(shù)比常規(guī)接種方法所構(gòu)建的組織工程軟骨對豬膝關(guān)節(jié)負重區(qū)軟骨缺損的修復效果好,但是相比而言,單抗CD44-Biotin-Avidin綁定技術(shù)所構(gòu)建的組織工程軟骨的修復效果更佳,雖然仍未達到自體移植修復水平,但部分指標和自體移植已無統(tǒng)計學差異。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R318.0

【參考文獻】

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4 陳雷;楊志明;林建華;李秀群;;組織工程軟骨對兔膝關(guān)節(jié)脛骨平臺淺層全關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復作用[J];中華實驗外科雜志;2006年08期

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本文編號：2409437