【摘要】：心血管疾病嚴重威脅著人類的健康，每年有17.3千萬人死于心血管疾病。使得血管移植物的臨床需求在全球范圍內(nèi)日益增大。外周血管閉塞或損傷替代、冠狀動脈旁路移植、血液透析動靜脈造瘺等都需要小口徑血管移植物�，F(xiàn)在肝、腎、肺等復(fù)雜器官構(gòu)建以及大段骨缺損修復(fù)等都需要血管化，移植后血管的再通往往是影響構(gòu)建器官能否存活并宿主化的關(guān)鍵，因而小口徑血管的移植和構(gòu)建也是復(fù)雜器官構(gòu)建的關(guān)鍵科學問題之一。構(gòu)建不需要體外種植內(nèi)皮細胞的“現(xiàn)用型”組織工程血管是未來發(fā)展的方向。但是小口徑組織工程血管（＜6mm）移植后由于早期血栓形成、中遠期內(nèi)膜增生、鈣化等問題一直制約著其進一步的臨床運用。因此，構(gòu)建能夠長期保持通暢的小口徑工程血管仍是世界性的挑戰(zhàn)。針對小口徑組織工程血管血栓形成和內(nèi)膜增生的難題，從仿生學入手深入研究血管植入物和血管周圍環(huán)境的交互作用，能為構(gòu)建長期通暢的小口徑工程血管帶來新的突破。 工程血管體內(nèi)植入后首先接觸的是流動的血液。血液中有著大量的細胞，其中內(nèi)皮祖細胞(EPCs)是一種能直接分化為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，血液中內(nèi)皮祖細胞含量增高時能直接修復(fù)損傷的血管，進而減少內(nèi)膜增生和血栓形成，降低血管的再狹窄率。組織工程血管迅速內(nèi)皮化是克服小口徑血管血栓形成和內(nèi)膜增生，提高血管通暢率的有效方法。因此如何促進工程血管內(nèi)皮化，成為倍受關(guān)注的難點和熱點。而誘導內(nèi)皮祖細胞歸巢于組織工程血管為其內(nèi)皮化帶來了新的機遇。 從解剖生理上看，血管和神經(jīng)常常形成血管神經(jīng)束相伴前行，血管和神經(jīng)的生長方式非常相似，它們循著相同的遷移路線，相互依賴，血管的活動和營養(yǎng)受神經(jīng)調(diào)節(jié)。從發(fā)育生物學看，血管和神經(jīng)更是息息相關(guān)，血管的發(fā)生和軸突的生長可以使用共同信號。軸突的生長可能對血管生物學行為產(chǎn)生重要影響。但是神經(jīng)因素對工程血管的體內(nèi)構(gòu)建是否產(chǎn)生影響尚不清楚（科學問題之一）。盡管內(nèi)皮化具有重要作用，但小口徑PTFE人造血管在內(nèi)皮化后仍然導致血栓形成，長期移植通暢率不高，是否與其不能降解因而缺乏與周圍環(huán)境中的神經(jīng)因素相互作用尚不清楚。那么，神經(jīng)重建是不是組織工程血管長期通暢的充要條件，是可有可無還是不可或缺（科學問題之二）。 冠脈搭橋等需要小口徑工程血管，而冠狀動脈和頸內(nèi)外動脈都要受第十對腦神經(jīng)迷走神經(jīng)分支的支配，迷走神經(jīng)起始部位——延髓橄欖后溝富含腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）。已有研究發(fā)現(xiàn)BDNF不僅對神經(jīng)生長和突觸的可塑性有重要作用，而且在整個圍血管形成期作用于心臟、骨骼肌和大動脈等特定器官組織。BDNF對于心血管和中心動脈有著比較特異的作用，而冠狀動脈、頸動脈等正屬于心血管和中央動脈。但BDNF對于用于冠脈搭橋等的工程血管構(gòu)建有無影響，目前尚不清楚，值得深入研究。 在此基礎(chǔ)上，要回答神經(jīng)調(diào)控對于工程血管是可有可無，還是不可或缺還必須構(gòu)建一個神經(jīng)支配的工程血管，并通過阻斷神經(jīng)支配來進行研究。選擇一個同時具有血管效應(yīng)和神經(jīng)效應(yīng)，并且存在各自獨立受體的分子非常必要。而BDNF沒有獨立的血管效應(yīng)和神經(jīng)效應(yīng)的受體，并不適合作為模式分子。篩選軸突生長誘導分子家族Ephrins、Semaphorins、Slits、Netrins，，發(fā)現(xiàn)前三者主要功能是抑制，而Netrins的功能是吸引軸突生長。而且Netrins家族在血管和神經(jīng)軸突的發(fā)育過程中都扮演著重要的角色。尤其是Netrin-1不僅誘導神經(jīng)軸突的生長而且能夠促進血管的萌芽和新生。A2b作為腺苷的一個受體也被確認為Netrin-1的受體在改善缺血和抗炎方面發(fā)揮作用。DCC作為神經(jīng)效應(yīng)受體介導Netrin-1誘導軸突的發(fā)育。因此，Netrin-1可以作為一個很好的工具便于我們研究神經(jīng)調(diào)控對工程血管遠期通暢的影響及分子機制。 圍繞這兩個重要的科學問題，基于以上研究背景我們展開了以下四個方面的深入研究： 一、組織工程血管支架構(gòu)建及表面修飾 選擇具有良好力學強度和生物相容性的支架材料是組織工程血管構(gòu)建的首要要求。我們選擇大鼠頸動脈，采用獨特的脫細胞技術(shù)，保留血管原有的膠原纖維和彈力纖維，用RNA酶，DNA酶、脂肪酶去除核酸和脂肪，得到直徑達到1mm，具有良好力學強度，和生物相容性的血管脫細胞基質(zhì)材料。 膠原和殼聚糖都是天然高分子可降解材料，我們利用膠原包裹BDNF孵育已經(jīng)制備好的血管基質(zhì)材料，之后通過EDC對孵育了膠原的血管基質(zhì)材料進行交聯(lián)。進而在通過SPDP偶聯(lián)蛋白的方法將BDNF再一次偶聯(lián)于工程血管內(nèi)表面，進而構(gòu)建出BDNF修飾的小口徑組織工程血管。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)膠原均勻覆蓋血管內(nèi)表面，進一步檢測BDNF已經(jīng)成功偶聯(lián)于工程血管內(nèi)表面。 在此基礎(chǔ)上為了達到更好的長時程緩釋目的，我們將殼聚糖納米顆粒包裹Netrin-1交聯(lián)于已經(jīng)制備好的血管基質(zhì)材料，再交聯(lián)膠原。之后通過SPDP進一步偶聯(lián)Netrin-1于工程血管內(nèi)表面實現(xiàn)層層自組裝，構(gòu)建了Netrin-1修飾的小口徑組織工程血管，并同時針對Netrin-1的不同受體分別構(gòu)建了A2b受體阻斷的小口徑組織工程血管和DCC受體阻斷的小口徑組織工程血管。檢測發(fā)現(xiàn)Netrin-1能夠在工程血管中穩(wěn)定緩慢均勻釋放一個月。 二、神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員通過促進內(nèi)皮祖細胞募集提高小口徑工程血管通暢率 鑒于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員BDNF對于心血管和中央動脈有特異性的作用，但是其對于冠脈搭橋所需的小口徑工程血管有無影響，尚不清楚。我們通過甲基纖維素半固體培養(yǎng)法研究發(fā)現(xiàn)BDNF可以促進早期內(nèi)皮祖細胞單克隆形成和旁分泌。通過旁分泌，進一步促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移。而且Edu染色和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)BDNF還能明顯誘導晚期內(nèi)皮祖細胞增殖和遷移。并促進晚期內(nèi)皮祖細胞在膠原電紡絲材料上向內(nèi)皮細胞分化。通過離體平板流動腔模擬在體血液流變學狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)BDNF修飾的涂層膠原材料能夠捕獲流體中更多的內(nèi)皮祖細胞，而通過阻斷其受體TrkB后，捕獲的內(nèi)皮祖細胞明顯減少。通過C57BL/6小鼠鐵絲損傷模型發(fā)現(xiàn)BDNF能夠促進鐵絲損傷后C57BL/6小鼠EPCs從骨髓動員到外周。并且BDNF能夠促進內(nèi)皮祖細胞歸巢到頸總動脈受損部位。 我們進而將構(gòu)建的BDNF修飾的組織工程血管移植到大鼠頸總動脈，8周后發(fā)現(xiàn)對照組僅有一只通暢（n=10），而BDNF修飾的處理組有9只通暢（n=10）。多普勒血流儀檢測發(fā)現(xiàn)，BDNF修飾的組織工程血管血流量平均4.98ml/min，而對照組組織工程血管平均血流量只有0.46ml/min。將沒有完全栓塞的對照組組織工程血管和BDNF修飾的組織工程血管作冰凍切片，發(fā)現(xiàn)BDNF修飾的組織工程血管已經(jīng)形成較為完整的內(nèi)皮細胞層和平滑肌細胞層，明顯優(yōu)于對照組。我們將組織工程血管剖開作鋪片，在共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)BDNF修飾的組織工程血管其內(nèi)皮化程度明顯高于對照組，掃描電鏡顯示每個高倍視野平均內(nèi)皮細胞數(shù)量是對照組的大約5倍。由此可見，BDNF能夠通過促進內(nèi)皮祖細胞募集誘導組織工程血管內(nèi)皮化，從而提高小口徑工程血管的通暢率。 三、神經(jīng)支配的小口徑組織工程血管在體構(gòu)建及模式分子的生物學功能 以上研究我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員能夠促進小口徑工程血管的體內(nèi)構(gòu)建，但是神經(jīng)調(diào)控對工程血管的長期通暢是可有可無還是不可或缺，仍然不清楚。我們通過Netrin-1這一模式分子做工具構(gòu)建了Netrin-1修飾的小口徑組織工程血管及其相應(yīng)的血管效應(yīng)受體（A2b）阻斷組和神經(jīng)效應(yīng)受體（DCC）阻斷組的小口徑組織工程血管。移植2個月后對照組與A2b阻斷組基本已經(jīng)堵塞，而Netrin-1和DCC阻斷組保持通暢，但是DCC阻斷組有明顯的內(nèi)膜增生。Netrin-1組平均血流為4.53±2.49ml/min，而DCC阻斷組平均血流為2.22±1.56ml/min。移植后6個月，Netrin-1組保持通暢，平均血流量4.98±1.97ml/min.。血管外膜和中膜可以看到PGP9.5的陽性表達，提示有神經(jīng)纖維附著到血管的外膜和中膜。而DCC阻斷組工程血管移植6個月后出現(xiàn)了非常嚴重的內(nèi)膜增生，通暢率為降為40%（n=10），平滑肌細胞過度增殖，平均血流量為1.66±1.59ml/min。PGP9.5染色無陽性。移植14個月后發(fā)現(xiàn)Netrin-1修飾的工程血管仍然通暢，通暢率為91%（n=11），無內(nèi)膜增生，平滑肌無過度增殖，平均血流為5.47±2.34ml/min。血管外膜和中膜出現(xiàn)明顯豐富的PGP9.5陽性表達。而DCC阻斷組工程血管基本閉塞，通暢率僅為10%（n=10）。移植后24個月Netrin-1修飾的工程血管仍然保持通暢，通暢率為100%（n=5）。已經(jīng)有較為完整的神經(jīng)纖維分布于工程血管周圍�？梢娢覀兝肗etrin-1這一模式分子成功在體構(gòu)建了神經(jīng)支配的小口徑組織工程血管。隨著神經(jīng)纖維長入工程血管，工程血管通暢率提高，內(nèi)膜增生減少；而阻斷神經(jīng)纖維的長入，工程血管的通暢率下降，出現(xiàn)嚴重的內(nèi)膜增生。 Netrin-1作為一個模式分子其在小口徑工程血管構(gòu)建中的作用值得深入研究。研究發(fā)現(xiàn)在工程血管內(nèi)皮化前，Netrin-1通過激活A(yù)2b受體上調(diào)血小板的cAMP水平減少血小板的聚集及粘附；在工程血管內(nèi)皮化過程中，Netrin-1維持早期EPC干性，增強其旁分泌功能，并促進內(nèi)皮祖細胞動員和捕獲；在工程血管神經(jīng)化過程中，Netrin-1通過促進神經(jīng)軸突再生誘導神經(jīng)元分泌多種活性因子及microRNAs。 四、神經(jīng)調(diào)控影響工程血管遠期通暢的分子機制 有神經(jīng)纖維生長的工程血管通暢率提高，但是其分子機制如何值得深入研究。我們需要進一步表征神經(jīng)纖維在工程血管分布的情況和規(guī)律。通過血管外膜的神經(jīng)纖維免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)移植后6個月時Netrin-1修飾的小口徑組織工程血管已有神經(jīng)纖維分布于血管外膜，而DCC阻斷組幾乎沒有。14個月時Netrin-1修飾的小口徑組織工程血管外膜到中膜都出現(xiàn)神經(jīng)纖維，而且神經(jīng)纖維形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。同時做血管外膜的神經(jīng)纖維逆行示蹤并從血管鄰近的頸上神經(jīng)節(jié)觀察被示蹤到的神經(jīng)元胞體。血管移植6個月后發(fā)現(xiàn)，Netrin-1修飾組，血管移植側(cè)頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)有較多神經(jīng)元被示蹤，而DCC阻斷組頸上神經(jīng)節(jié)僅有少量神經(jīng)元被示蹤，數(shù)量明顯少于Netrin-1組。移植14個月后，Netrin-1組進行血管移植側(cè)神經(jīng)纖維逆行示蹤可見有更多的神經(jīng)元胞體在頸上神經(jīng)節(jié)被示蹤。而DCC阻斷組幾乎無神經(jīng)元被示蹤。。通過乙酰膽堿能神經(jīng)纖維銀染發(fā)現(xiàn)移植后14個月，Netrin-1組工程血管外膜有乙酰膽堿能神經(jīng)纖維存在，而DCC阻斷組沒有發(fā)現(xiàn)。并且掃描電鏡、Masson染色以及MyCH免疫熒光染色顯示神經(jīng)纖維長入工程血管的程度與工程血管內(nèi)皮化水平和平滑肌功能重建呈正相關(guān)。我們還首次發(fā)現(xiàn)microRNA143、microRNA204可以類似激素隨著神經(jīng)纖維的長入被從神經(jīng)節(jié)運輸并分泌到保持通暢長達24個月的神經(jīng)支配的工程血管外膜及中膜，有助于保護血管，防止鈣化。并且發(fā)現(xiàn)Netrin-1修飾的小口徑組織工程血管外膜、中膜和內(nèi)膜表達BDNF、Netrin-1隨著移植時間推移逐漸增多，可能是通過神經(jīng)纖維的軸漿運輸達到工程血管。進一步研究發(fā)現(xiàn)BDNF可以通過Erk通路促進平滑肌在膠原上正常增殖，而Netrin-1可以抑制平滑肌細胞病理增殖并促進其功能性骨架蛋白的表達。這對調(diào)控工程血管的遠期通暢都起到了積極作用。 綜上所述，本論文通過四個部分的研究，首先利用脫細胞材料和天然高分子材料復(fù)合的關(guān)鍵技術(shù)，構(gòu)建了小直徑1mm的組織工程血管，并成功控制因子的長時程釋放。在此基礎(chǔ)上，從工程血管移植后與周圍微環(huán)境的交互作用入手，發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)因子能夠調(diào)控內(nèi)皮祖細胞歸巢于工程血管從而提高工程血管內(nèi)皮化水平。進一步構(gòu)建了神經(jīng)支配的小口徑工程血管，證實了神經(jīng)長入可以調(diào)控工程血管的內(nèi)皮化水平和平滑肌重建等，從而顯著提高了小口徑工程血管的遠期通暢率。證明了神經(jīng)調(diào)控對于小口徑工程血管的遠期通暢不是可有可無，而是不可或缺。為構(gòu)建臨床可用的“現(xiàn)用型”小口徑組織工程血管奠定了基礎(chǔ)。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.11

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 涂秋芬;張怡;李艷;陳槐卿;;一種新型的脫細胞組織工程血管支架的構(gòu)建和評價[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2007年02期

本文編號：2398256