【摘要】：甲殼素和殼聚糖不但生物相容性好，止血效果優(yōu)異，而且可生物降解，因此在止血材料方面有大量的研究并已有一定的應(yīng)用。然而現(xiàn)有標準難以保證組織臟器止血用殼聚糖的安全和性能；我國也已有殼聚糖等可吸收材料的臨床不良反應(yīng)報道。因此研究止血用殼聚糖的質(zhì)量和安全控制方法，開展止血用殼聚糖的質(zhì)量標準研究，對于保障止血用殼聚糖的質(zhì)量有重要的學(xué)術(shù)意義，并為促進殼聚糖在止血材料等領(lǐng)域等研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。 殘留蛋白質(zhì)可能引起過敏反應(yīng)影響殼聚糖作為止血材料的安全性，而堿提等脫蛋白方法為非均相反應(yīng)，且蛋白質(zhì)與殼聚糖結(jié)合強，因此脫蛋白效率較低。此外堿提等方法可能導(dǎo)致殼聚糖分子量降低。為此采用固定化酶技術(shù)研究了殼聚糖在溶液中脫除蛋白質(zhì)殘留的方法：通過研究不同硅原比例對固定化酶的固定化率、酶活力和蛋白選擇性的影響，確定了以四甲氧基硅烷：氨丙基三乙氧基硅烷（TMOS:ATPES）90:10對胃蛋白酶的固定條件。固定化酶的蛋白酶活力為游離酶的125.3%±14.3%，蛋白質(zhì)底物選擇性也提高為游離酶的2.7倍。同時研究了溫度和pH對固定化酶蛋白酶活力和酶選擇性的影響，并建立了以pH4.5，45℃條件下固定化酶對殼聚糖溶液溫孵160min的脫除蛋白質(zhì)方法。該方法可有效脫除殼聚糖中53.8-80.4%殘留蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)殘留量降低至0.12%～0.34%，脫蛋白效果顯著優(yōu)于堿提法。 受到殼聚糖的干擾，殼聚糖中微量蛋白質(zhì)殘留難以靈敏、準確的定量測定。為減少殼聚糖的干擾，研究了水解后芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）柱前衍生HPLC法測定殼聚糖中微量蛋白質(zhì)殘留。研究了大量殼聚糖水解產(chǎn)物干擾時氨基酸的FMOC-Cl衍生條件，及16種氨基酸和氨基葡萄糖的FMOC-Cl衍生產(chǎn)物在不同pH條件的色譜行為，建立了殼聚糖中微量蛋白含量的方法。該方法對各氨基酸的線性關(guān)系良好（r0.99），精密度（RSD）1.6%～8.5%，定量限1.9～10.9ng·mL~(-1)，回收率84.4%～98.6%。與考馬斯亮藍染色法、元素分析法和FMOC-Cl柱前衍生LC-MS/MS法相比方法靈敏、準確。 病毒污染會嚴重威脅殼聚糖作為止血材料的安全性，而相關(guān)的研究報道很少。對殼聚糖中病毒的表征和滅活方法進行了研究：以豬細小病毒（PPV）和牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）為指示病毒，研究了γ射線輻照和NaOH-乙醇溶液等處理方法對殼聚糖病毒滴的滅活以及殼聚糖分子量、脫乙酰度的影響。發(fā)現(xiàn)輻照劑量增強，殼聚糖分子量顯著降低，但30kGy時仍無法完全滅活病毒（ΔlgTCID_(50)4.0）；NaOH-乙醇溶液可降低病毒滴度，且NaOH濃度是最主要影響因素。建立了8mol·L-1NaOH的10%乙醇溶液35℃處理1h后γ射線輻照5kGy的病毒滅活方法，該方法可有效滅活病毒（ΔlgTCID_(50)4.0），并僅引起殼聚糖分子量降低8.4%。 受水解中的褐變降解影響，殼聚糖含量測定準確度較低，回收率約90%。為提高含量測定的準確度，研究不同比例鹽酸和磷酸條件下氨基葡萄糖和殼聚糖褐變，并確定了5-羥甲基糠醛和脫氧果糖嗪等主要褐變產(chǎn)物，，建立了鹽酸-磷酸（4.5:1.5mol·L~(-1)）水解結(jié)合柱前衍生HPLC法測定殼聚糖含量的方法。采用鹽酸-磷酸（4.5:1.5mol·L~(-1)）可抑制殼聚糖水解中的褐變降解，使回收率由鹽酸水解的5.1%提高至97.7%，同時方法在20～300μg·mL~(-1)范圍內(nèi)線性良好（r0.99），精密度高（RSD2.9%-3.9%）。 因缺乏止血用殼聚糖的質(zhì)量標準，對殼聚糖的各主要質(zhì)量指標及其測定方法進行了比較和評價，并參考國內(nèi)外殼聚糖標準及外科植入物的質(zhì)量要求，提出了止血用殼聚糖質(zhì)量標準，為我國止血用殼聚糖的質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)。 論文建立了固定化胃蛋白酶脫除蛋白質(zhì)殘留純化殼聚糖的方法，其效果顯著優(yōu)于非均相的堿提法；建立了靈敏、準確的柱前衍生HPLC法測定殼聚糖中微量蛋白質(zhì)殘留；建立了鹽酸-磷酸水解柱前衍生HPLC法測定殼聚糖含量，抑制了水解中的褐變，顯著提高了方法的回收率，對于殼聚糖的全面質(zhì)量控制有重要的意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

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本文編號：2393161