【摘要】：蜘蛛大壺腹腺產(chǎn)生的牽引絲具有優(yōu)良的機械特性，是自然界綜合性能最好的天然生物材料之一，具有高強度、高彈性和高斷裂功的特點，其強度為鋼絲的5倍，韌度為Kelvar纖維的3倍；在低溫和高溫等極端條件下，天然蜘蛛絲仍然具有優(yōu)異的性能�；谶@些獨特的物理和生物學(xué)特性，蜘蛛牽引絲在醫(yī)學(xué)、材料、軍事等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，蜘蛛的天性決定了無法通過大規(guī)模飼養(yǎng)的途徑獲取大量蜘蛛絲蛋白，因此利用基因工程的方法異源表達重組蜘蛛絲蛋白就成為規(guī)�；@取蜘蛛絲蛋白的有效途徑。 通過應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)和高分子化學(xué)手段研究天然蜘蛛絲的組成、結(jié)構(gòu)、性能及其形成原理，研究人員提出了一種新的基于天然蜘蛛絲蛋白結(jié)構(gòu)的基因工程方法，依據(jù)蜘蛛絲蛋白高度保守的結(jié)構(gòu)域以及具有大量串聯(lián)重復(fù)的一致序列的特點，通過分子克隆的手段獲取接近天然長度的編碼基因，利用多種表達系統(tǒng)獲得與天然蜘蛛絲蛋白極其相似的蛋白質(zhì)，并模擬天然蜘蛛絲成絲過程，在體外成功制備出人工蜘蛛絲纖維，這為具有成本效益地大規(guī)模人工生產(chǎn)蜘蛛絲提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。 在基因工程蜘蛛絲蛋白核心序列研究方面，目前已經(jīng)研究清楚蜘蛛絲蛋白有幾大類重復(fù)基序，基本上可以歸納為丙氨酸富含基序(An/(GA) n)、GPGXX五肽基序、GGX基序和間隔區(qū)（Spacer）基序四類，這四類基序形成有一定特征的結(jié)構(gòu)來履行獨特的功能。其中丙氨酸富含基序形成β-折疊片層，為蜘蛛絲提供強度；GPGXX五肽基序形成β-轉(zhuǎn)角螺旋，為蜘蛛絲提供高的彈性�；谔烊恢┲虢z優(yōu)良特性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是由4個簡單重復(fù)的氨基酸基序組成的非常保守的蛋白序列，可以采取將關(guān)鍵功能單元進行重復(fù)性拼接來獲得基因工程蜘蛛絲蛋白編碼基因序列。目前，國際上普遍采用將這些高度保守的功能單元組合拼接，實現(xiàn)基因工程蜘蛛絲全長序列的構(gòu)建，并且獲得了性能接近天然蜘蛛絲的人工合成蜘蛛絲。因此，通過基因重組的方式，對核心單元串聯(lián)拼接的構(gòu)建方式是通過研究證實的、行之有效的基因工程蜘蛛絲編碼基因克隆的通用策略。 結(jié)合基因工程蜘蛛絲合成當(dāng)前的國內(nèi)外研究進展以及存在的一些問題，本論文主要從以下三個方面開展相關(guān)研究工作： 第一部分：基因工程蜘蛛絲蛋白分子設(shè)計 本部分研究首先檢索國際上已有報道的基因工程蜘蛛絲蛋白的核心結(jié)構(gòu)單元，從中選取具有代表性的基因工程蜘蛛絲核心序列與天然的蜘蛛牽引絲蛋白核心序列通過計算機輔助分子模擬技術(shù)，模擬其可能的空間構(gòu)象，進而挑選出一條在空間結(jié)構(gòu)上最接近于天然蜘蛛絲蛋白的序列；隨后根據(jù)大腸桿菌的三聯(lián)體密碼子偏好性，選取蜘蛛絲核心序列所對應(yīng)的大腸桿菌偏性密碼子，從而設(shè)計出適用于大腸桿菌系統(tǒng)表達的基因工程蜘蛛絲核心基因編碼序列；最后根據(jù)核心序列串聯(lián)拼接及原核表達載體構(gòu)建中所需要的限制性內(nèi)切酶位點，在核心序列的兩端分別加上克隆酶切位點，并于序列兩端加上保護堿基。 通過分析與設(shè)計，設(shè)計獲得了長度為135bp的基因工程蜘蛛絲核心基因序列，以該序列作為單體，通過后續(xù)的連續(xù)串聯(lián)拼接，可以獲得接近天然蜘蛛絲基因序列長度的目的基因，從而為后續(xù)開展基因工程蜘蛛絲編碼基因克隆以及表達載體構(gòu)建研究提供可靠的序列信息。 第二部分：基因工程蜘蛛絲核心序列的拼接及載體構(gòu)建 獲取基因工程蜘蛛絲重組載體是本項目開展的重要基礎(chǔ)性工作，通過分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建接近天然蜘蛛絲大小的串聯(lián)拼接基因片段是最終決定基因工程蜘蛛絲性能的關(guān)鍵。 本部分研究我們采用同尾酶連接法進行基因工程蜘蛛絲基因序列的串聯(lián)拼接，以全基因合成的核心序列單倍串聯(lián)體——pBSK1序列為基礎(chǔ)，分別進行XmaI/Sca I和BspE I/Sca I雙酶切，回收酶切目的片段，T4連接酶快速連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，重組子經(jīng)過Amp抗性篩選和重組克隆載體的酶切鑒定，得到2倍串聯(lián)體克隆重組子，在此基礎(chǔ)上重復(fù)上述過程，使得核心序列依次倍加，最終獲得96串聯(lián)體克隆重組子；對所有的克隆重組子進行酶切鑒定，確認插入的目的基因片段大小無誤。最后，將構(gòu)建的克隆載體酶切，連接至已經(jīng)線性化的pET28a(+)質(zhì)粒，，構(gòu)建出含有蜘蛛絲核心序列的串聯(lián)體原核表達載體。 本部分研究利用基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)手段，獲得了基因工程蜘蛛絲2-96倍串聯(lián)體克隆載體，并構(gòu)建出含有蜘蛛絲核心序列的串聯(lián)體原核表達載體。經(jīng)限制性內(nèi)切酶反應(yīng)鑒定插入序列完全正確，上述克隆載體和表達載體的獲得為下一步基因工程蜘蛛絲的原核表達奠定了基礎(chǔ)。 第三部分：基因工程蜘蛛絲蛋白的表達與鑒定 如何將構(gòu)建的蜘蛛絲蛋白表達載體導(dǎo)入到原核或真核細胞中實現(xiàn)高效表達；并通過優(yōu)化純化方法獲取大量高純度的蜘蛛絲蛋白是進行蜘蛛絲紡絲的重要前提。 本部分研究旨在鑒定所構(gòu)建的基因工程蜘蛛絲不同串聯(lián)體的表達載體能夠在大腸桿菌中正確表達目的片段，我們將原核表達載體轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)中，獲取轉(zhuǎn)化陽性克隆菌株后，在37℃培養(yǎng)至OD600約0.6后，加IPTG至終濃度為1mmol/L，于30℃誘導(dǎo)表達6h后，收獲培養(yǎng)細胞，制備全菌裂解液上清，以10%的SDS-PAGE電泳和蛋白免疫印跡實驗對目的蛋白的表達情況進行鑒定。 結(jié)果表明：空載體對照pET28a(+)沒有檢出相關(guān)蛋白的表達，而不同串聯(lián)體基因工程蜘蛛絲蛋白表達載體均檢測到有目的重組蛋白的表達，且產(chǎn)物大小分別與預(yù)期相對分子質(zhì)量一致。除上述特異性目的蛋白之外，均未發(fā)現(xiàn)有其他截斷的陽性蛋白條帶存在，同時也說明在基因工程蜘蛛絲蛋白原核表達過程中，未發(fā)生提前翻譯終止的現(xiàn)象和基因刪節(jié)表達現(xiàn)象。本部分研究驗證了所構(gòu)建的基因工程蜘蛛絲表達載體的正確性，并初步獲得重組目的蛋白的表達，為下一步開展基因工程蜘蛛絲蛋白的高密度發(fā)酵工作奠定基礎(chǔ)。 綜上所述，本研究以研制高強度的基因工程蜘蛛絲為目標，圍繞基因工程蜘蛛牽引絲蛋白Masp1原核表達載體構(gòu)建及蛋白表達的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，通過計算機輔助的分子設(shè)計方法，篩選了空間結(jié)構(gòu)與天然蜘蛛絲最為相近的核心序列；利用同尾酶連接方法，將單倍體依次串聯(lián)拼接，成功構(gòu)建了2-96串聯(lián)體基因工程蜘蛛牽引絲蛋白Masp1原核表達載體，在此基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了上述表達載體在大腸桿菌中的表達，驗證了所構(gòu)建載體的正確、充分地表達，并無表達提前終止的現(xiàn)象。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08

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本文編號：2369302