【摘要】：在低溫醫(yī)學(xué)的研究和臨床應(yīng)用中,亞低溫的腦保護(hù)作用得到了廣泛的公認(rèn)和長足的發(fā)展,尤其是在特重型顱腦損傷(severe craniocerebral injury)的救治方面,亞低溫通過降低腦組織代謝率、抑制鈣超載、減輕自由基蓄積、穩(wěn)定線粒體膜功能等方面發(fā)揮腦保護(hù)作用。隨著研究的逐漸深入,發(fā)現(xiàn)亞低溫治療雖然能有效降低重型顱腦損傷的死亡率,但仍然有約25%左右的急性期死亡率。于是有關(guān)深低溫的研究變提上議事日程。深低溫停循環(huán)(deep hypothermic circulation arrest, DHCA)的研究和臨床應(yīng)用始于上世紀(jì)的50年代,20年之后,DHCA技術(shù)廣泛使用于復(fù)雜先心病、主動脈弓及胸主動脈等大血管手術(shù)中,能發(fā)揮有效的神經(jīng)功能保護(hù)作用,隨著研究的深入和停循環(huán)時間的延長,DHCA又可引起近期和遠(yuǎn)期嚴(yán)重并發(fā)癥,而DHCA結(jié)合間斷性腦低流量灌注或順行性腦灌注/逆行性腦灌注能顯著降低單獨使用DHCA時并發(fā)癥的發(fā)生率,因此該技術(shù)的臨床應(yīng)用收到一定的限制。那么究竟DHCA的損傷或者保護(hù)作用是通過哪些蛋白質(zhì)實現(xiàn)的呢,如何才能有效放大其保護(hù)作用而降低并發(fā)癥的發(fā)生呢?眾所周知,蛋白質(zhì)是生物體功能的執(zhí)行單位,不同的功能狀態(tài)一定伴隨著蛋白質(zhì)的變化或者蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變,而差異蛋白質(zhì)組學(xué)正是在此基礎(chǔ)上得以產(chǎn)生和發(fā)展。蛋白質(zhì)組學(xué)始于1994年,在基因組學(xué)研究逐漸完成之后迅速興起的生命科學(xué)研究的熱點。經(jīng)典的方法是雙向凝膠電泳(2D-PAGE)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF-MS),該方法的優(yōu)點是技術(shù)成熟穩(wěn)定,對實驗室的條件要求相對較低,缺點是對于低豐度蛋白質(zhì)、相對分子量200KD和相對分子量8KD極小蛋白質(zhì)、極堿性蛋白和疏水性蛋白等都難以進(jìn)行有效分離。在2004年美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Incorporation, ABI)推出相對和絕對定量核素標(biāo)記(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, i-TRAQ)技術(shù),該技術(shù)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid Chromatography-Mass Separation/Mass Spectra Characterization, LC-MS/MS,也稱液相色譜-二維質(zhì)譜)結(jié)合,形成新的蛋白質(zhì)組學(xué)方法。該方法可對復(fù)雜標(biāo)本如細(xì)胞器、細(xì)胞裂解液等樣本進(jìn)行研究,具有較好的定量效果和較高的重復(fù)性,同時可以對雙向電泳無法處理的低豐度蛋白及特殊性質(zhì)蛋白質(zhì)的鑒定。目前在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究主要集中于癲癇、Parkin's病及精神障礙等功能性疾病的差異蛋白質(zhì)篩查。在神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面,多數(shù)為利用雙向凝膠電泳技術(shù)對膠質(zhì)瘤、顱腦損傷、功能性神經(jīng)外科疾病及蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣等的研究。在缺血缺氧性腦損傷研究方面,有采用2-DE的方法研究大鼠海馬組織在慢性腦缺血后的差異蛋白質(zhì)表達(dá)。線粒體是細(xì)胞能量的轉(zhuǎn)換器,是細(xì)胞的能量工廠,三羧酸循環(huán)、電子傳遞鏈及氧化磷酸化均在線粒體內(nèi)進(jìn)行。線粒體在整合各種信號刺激、決定細(xì)胞命運的過程中起著樞紐的作用,即最終形成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或者死亡的結(jié)果。目前認(rèn)為線粒體是缺血性損害亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的靶目標(biāo),其中細(xì)胞壞死是一個不可逆的過程,而細(xì)胞凋亡是可逆的過程,因此通過多種機制保護(hù)線粒體功能為缺血缺氧性腦病治療提供思路。在腦缺血時線粒體蛋白自身表達(dá)的差異可能是線粒體在凋亡過程中起決定作用的物質(zhì)基礎(chǔ),研究這些差異蛋白,對闡述疾病機制、選擇藥物作用的靶點,對缺血性神經(jīng)元損傷的防治有著重要意義。課題組建立了猴腦選擇性深低溫停循環(huán)模型,實現(xiàn)了腦循環(huán)和體循環(huán)的相對分離,將腦溫控制在深低溫(16℃)水平時可以實現(xiàn)中心體溫在33℃以上。猴腦極限缺血實驗結(jié)果顯示：腦血流阻斷同時或者10min后開始深低溫腦灌注組猴全部存活、無任何腦神經(jīng)功能障礙,MRI和病理顯示腦組織未見異常；腦血流阻斷20分鐘后開始深低溫腦灌注組猴則全部死亡,進(jìn)一步驗證了深低溫的腦保護(hù)作用,同時表明腦組織缺血缺氧的極限時間是10分鐘。在此基礎(chǔ)上,我們設(shè)計了本實驗。本研究共分為四個部分,第一部分為大鼠深低溫停循環(huán)動物模型的建立和免疫組化的驗證,模型主要部分采用了2006年我科研究生所用之相對成熟的模型,穿刺動脈由腹股溝動脈改為尾動脈；第二部分為海馬組織線粒體的提取純化和驗證(分別按照形態(tài)學(xué)驗證和標(biāo)記蛋白的Western-Blot驗證),采用梯度離心的方法；第三部分對線粒體蛋白質(zhì)標(biāo)本利用i-TRAQ結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)獲取肽段信息,Mascot 2.2軟件查庫鑒定和分析獲取蛋白質(zhì),最后經(jīng)統(tǒng)計分析獲得差異蛋白質(zhì),該部分內(nèi)容在中科院上海生命科學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)研究實驗室完成；第四部分按照同樣的方法完成動物模型,獲取海馬組織并冰凍超薄切片后,對所獲取的COX蛋白、單酰基甘油脂肪酶和G蛋白偶聯(lián)受體三個差異蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和半定量的逆向驗證(免疫組化熒光雙染色和Western-Blot)。第一部分大鼠深低溫停循環(huán)模型的建立及免疫組化驗證目的：通過插管的方法建立大鼠閉胸式體外循環(huán)模型,同時通過檢測額頂葉皮質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2 (Smad2)和低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)的表達(dá)間接判斷模型的穩(wěn)定性；方法：切開右側(cè)頸部和尾部皮膚,暴露頸內(nèi)靜脈和尾動脈,以帶側(cè)孔的16G導(dǎo)管和22G留置針分別穿刺頸內(nèi)靜脈和尾動脈,通過蠕動泵、大鼠用氧合器及變溫水箱等建立大鼠體外循環(huán)模型,手術(shù)中依氧飽和度調(diào)整灌注速度。分別完成常溫不停循環(huán)10min (33℃)、常溫停循環(huán)10min (33℃)和深低溫停循環(huán)10min (27℃)三組動物模型,快速斷頭取大鼠額頂葉皮質(zhì),制作石蠟切片,應(yīng)用HE染色和免疫組化法從蛋白質(zhì)水平研究Smad2和HIF-1α在缺血早期大鼠大腦皮層的表達(dá)情況。結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；結(jié)果：模型建立過程中,在深低溫組實現(xiàn)目標(biāo)中心體溫(27℃)的平均時間為10min,停循環(huán)10min后取皮質(zhì)和海馬并置于液氮中保存,另外兩組模型均順利完成。Smad2在DHCA組、NTCA組和NC組表達(dá)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)：且Smad2表達(dá)呈現(xiàn)出逐漸減少的趨勢；HIF-1α在DHCA組、NTCA組和NC組表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且HIF-1α表達(dá)同樣呈現(xiàn)出逐漸減少的趨勢；結(jié)論：通過插管的方法可以完成大鼠閉胸式體外循環(huán),模型重復(fù)性良好。Smad2和HIF-1α在三組動物模型額葉皮質(zhì)的表達(dá)有差異(P0.05)第二部分大鼠海馬線粒體的純化及電鏡和WeStern-Blot的驗證目的： 提取大鼠海馬組織線粒體并且純化,同時對所獲取線粒體形態(tài)和特異性等進(jìn)行驗證；方法：利用梯度離心的方法進(jìn)行線粒體的純化：海馬組織在冰面上碎化勻漿,加入相應(yīng)的蛋白酶抑制劑及其它試劑,多次不同速度離心、沉淀、再離心、再沉淀,最后去上清,洗脫線粒體沉淀,取0.1g加入1ml 4%多聚甲醛固定,送透射電鏡檢測；取30ug樣品行Western-blot檢測,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后,加Cox-Ⅳ抗體和二抗,染色后曝光；結(jié)果： 電鏡照片顯示線粒體提取純度較高,線粒體結(jié)構(gòu)完整,內(nèi)外膜清晰,內(nèi)部基質(zhì)均勻。Western-blot結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量在17KD位置,與Cox-Ⅳ理論分子量相符；結(jié)論：采用美國Thermo公司線粒體純化試劑盒能獲得純度較高的線粒體,同時線粒體超微結(jié)構(gòu)和特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)均可得到很好的保留,適合進(jìn)一步研究。第三部分基于i-TRAQ技術(shù)的大鼠海馬線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究目的：篩查常溫不停循環(huán)、常溫停循環(huán)、深低溫停循環(huán)時大鼠海馬線粒體的差異蛋白質(zhì),為進(jìn)一步深入研究DHCA腦保護(hù)機制提供線粒體靶蛋白。方法： 海馬線粒體蛋白質(zhì)標(biāo)本首先行SDS-PAGE電泳初步判斷合格后,經(jīng)蛋白酶解和肽段定量后,各組按照核素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)的要求進(jìn)行體外肽段標(biāo)記,經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分級后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,獲取肽段信息,Mascot 2.2軟件查庫鑒定和分析獲取蛋白質(zhì),統(tǒng)計分析獲得差異蛋白質(zhì)。結(jié)果：本實驗共獲得差異蛋白質(zhì)29個(在兩次重復(fù)實驗中同時滿足表達(dá)量1.5倍以上或者0.66倍以下且P0.05),包括腱糖蛋白C、纖溶酶原、假想蛋白loc365985、嘌呤合成雙功能蛋白、囊泡分揀蛋白45、G蛋白偶聯(lián)受體37、接觸偶聯(lián)蛋白1、無活性的磷脂酶C、貓眼綜合癥染色體蛋白、鈉氯依賴GABA轉(zhuǎn)運蛋、短蛋白聚糖核心蛋白異形體、髓磷脂相關(guān)的少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白、單酰基甘油脂肪酶、鈉氯依賴GABA轉(zhuǎn)運蛋白-1、絡(luò)蛋白激酶2亞單位、半胱氨酸-谷氨酸富含蛋白-1、細(xì)胞色素C氧化酶線粒體亞單位7A2、血紅蛋白亞單位、血紅蛋白b-l球蛋白、腫脹性成蟲盤長亞型和NIT 2蛋白末尾的酰胺酶等21個已知蛋白質(zhì),另外8個為未知蛋白質(zhì)。結(jié)論：深低溫停循環(huán)技術(shù)的腦保護(hù)作用與海馬線粒體的部分蛋白質(zhì)的差異表達(dá)有關(guān)。第四部分差異蛋白質(zhì)的驗證目的通過免疫熒光和Western-Blot方法對已獲取的COX7A2、單�；视椭久负虶蛋白偶聯(lián)受體37等部分差異蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和半定量的逆向驗證；方法取大鼠40只,按照前述相同步驟和分組建立動物模型,獲取大鼠海馬組織,冰凍超薄切片后按照免疫熒光雙染色的步驟染色確定性質(zhì),選取COX7A2、單酰基甘油脂肪酶和G蛋白偶聯(lián)受體37三種差異蛋白質(zhì),同時利用Western-Blot對相應(yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)行含量的半定量檢測；結(jié)果線粒體COX7A2、單�；视椭久负虶蛋白偶聯(lián)受體37三種蛋白定性準(zhǔn)確,免疫熒光反應(yīng)提示目標(biāo)蛋白質(zhì)在DHCA組位于胞質(zhì)內(nèi),而在其它組則可見較明顯的胞質(zhì)外染色,如大量重疊染色出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi),說明目標(biāo)蛋白質(zhì)已經(jīng)從胞漿線粒體內(nèi)釋放至線粒體外。半定量結(jié)果提示各組蛋白質(zhì)總表達(dá)量變化不明顯(P0.05)。結(jié)論深低溫停循環(huán)可抑制或者減輕線粒體COX7A2、單酰基甘油脂肪酶和G蛋白偶聯(lián)受體37等蛋白質(zhì)在急性缺血缺氧條件下由線粒體向線粒體外胞質(zhì)的釋放,由此推斷DHCA抑制或者減輕C0X蛋白等線粒體蛋白質(zhì)由線粒體內(nèi)向線粒體外胞質(zhì)的釋放是其在線粒體層面發(fā)揮腦保護(hù)作用的主要機制。
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【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.52

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2349808