【摘要】：血管移植手術(shù)是治療心血管疾病的主要手段。自體血管和人工合成血管是臨床上常用的血管移植物,但自體血管來源有限,難以滿足臨床需求。人工合成血管如滌綸(Dacron)和膨脹聚四氟乙烯(ePTFE)在大直徑血管(內(nèi)徑6mm)移植中有較佳的效果,但在小直徑血管(內(nèi)徑6mm)移植中容易出現(xiàn)形成血栓、內(nèi)膜增生、血管狹窄甚至阻塞等現(xiàn)象。組織工程血管技術(shù)為小直徑血管移植物提供了新來源。目前小直徑組織工程血管的構(gòu)建的方法包括體內(nèi)構(gòu)建和體外構(gòu)建：體外構(gòu)建包括誘導(dǎo)分化、細(xì)胞種植和體內(nèi)移植三個過程；體內(nèi)構(gòu)建是將復(fù)合有種子細(xì)胞的血管支架移植到動物體內(nèi)血管缺損部位,借助動態(tài)血流環(huán)境和體內(nèi)刺激構(gòu)建組織工程血管�；谶@兩種方法構(gòu)建的組織工程血管已有報道,但是尚未有能應(yīng)用于臨床。分析認(rèn)為存在以下問題：血管支架的生物學(xué)性能和力學(xué)性能不足；血管支架不具有多層次結(jié)構(gòu),不能為不同的血管細(xì)胞提供合適的微環(huán)境；應(yīng)用的種子細(xì)胞傳代次數(shù)有限,增殖能力不強(qiáng),基質(zhì)分泌受限,無法形成有效的組織工程血管；靜態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建的組織工程血管在力學(xué)性能和生理功能方面與天然血管存在差異。 針對這些問題,本研究結(jié)合前期的工作基礎(chǔ),采用集成的解決辦法,提出本研究思路：模擬血管多層結(jié)構(gòu),應(yīng)用靜電紡絲工藝,共混RGD-重組蛛絲蛋白(pNSR16)、聚己內(nèi)酯(PCL)、殼聚糖(CS)和明膠(Gt),構(gòu)建(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)雙層蛛絲蛋白血管支架,結(jié)合支架的降解性質(zhì)、生物力學(xué)性能、血液相容性和生物安全性的研究,全面評價血管支架的材料與生物學(xué)性能。優(yōu)化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及其分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法,研究其生物學(xué)特性,探討信號通路在血管支架與干細(xì)胞相互作用過程中的作用機(jī)制。模擬動物體內(nèi)的動態(tài)血流環(huán)境,將間充質(zhì)干細(xì)胞與血管支架復(fù)合動態(tài)培養(yǎng),在體外培養(yǎng)構(gòu)建形成類似天然血管的組織工程血管。將制備的小直徑組織工程血管修復(fù)SD大鼠血管缺損,考察其移植體內(nèi)后結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及血流通暢性,分析其修復(fù)血管的能力,為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 研究結(jié)果如下： 一、應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制備雙層蛛絲蛋白血管支架,并對其進(jìn)行理化性能的表征。同時制備了脫細(xì)胞血管支架作為性能評價的參照物,其管壁的彈性良好,管腔內(nèi)表面光滑。掃描電鏡觀察顯示雙層蛛絲蛋白血管支架微觀結(jié)構(gòu)為納米級纖維彼此交錯排列形成的三維多孔網(wǎng)狀；接觸角僅為47度,親水性能優(yōu)良；X射線光電子能譜(XPS)研究表明其光譜區(qū)域出現(xiàn)了P2p (134.57eV)信號,證實pNSR16整合進(jìn)了血管支架中；其具有較強(qiáng)的抗熱性能,優(yōu)于脫細(xì)胞血管支架；玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為32.01℃-44.43℃；經(jīng)105℃高溫處理3小時后,其水分喪失率為11.2%,高于脫細(xì)胞血管支架。 二、探討雙層蛛絲蛋白血管支架的生物力學(xué)性能與降解性能。其爆破強(qiáng)度、拉伸強(qiáng)度和縫合強(qiáng)度大小均與質(zhì)量分?jǐn)?shù)和管壁厚度成正比,孔隙率、水滲透性和斷裂伸長率大小與質(zhì)量分?jǐn)?shù)和管壁厚度成反比。爆破強(qiáng)度的范圍為39kPa-150kPa,高于生理血壓；縫合強(qiáng)度大于0.19N,滿足體內(nèi)移植的要求；拉伸強(qiáng)度高于人體橈動脈血管,滿足體內(nèi)移植的要求；水滲透性為0.3-06mL· min-1·cm-2。體外降解結(jié)果表明：其降解程度深于同等條件下的(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,血管支架在酶解液中的降解程度均高于在PBS中的降解；吸水率在12周時達(dá)到80%-90%,高于對照組；在降解液處理期間,其降解液pH值較為平穩(wěn),(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架降解液pH值下降趨勢明顯；其初始抗彎強(qiáng)度和初始分子量大于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,前者抗彎強(qiáng)度和分子量下降較快,而后者的抗壓強(qiáng)度下降較緩慢。體內(nèi)降解結(jié)果表明：血管支架在整個植入期內(nèi)不斷降解,(pNSR.16/PCL/CS)/(pNSRl6/PCL/Gt)支架降解程度更深,纖維斷裂嚴(yán)重,12周時失重率為20.3%,其降解速度明顯快于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,后者在12周時僅降解了13.2%。 三、評價雙層蛛絲蛋白血管支架的生物安全性與血液相容性。在血管支架浸提液培養(yǎng)條件下的間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)梭形,團(tuán)聚式增殖。大鼠腹腔注射血管支架生理鹽水浸提液,7天內(nèi)實驗組大鼠全部存活,與對照組比較,外觀未見異常改變,臟器指數(shù)在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異。皮膚刺激試驗結(jié)果表明,實驗組大鼠平均記分在0-0.4范圍內(nèi),無紅斑、水腫形成,屬于極輕微刺激反應(yīng)類型,HE染色表明無炎癥出現(xiàn)。在敷貼試驗中實驗組大鼠皮膚無明顯變化,無紅斑和水腫,平均反應(yīng)等級都為0。彗星電泳試驗表明血管支架浸提液不會對細(xì)胞造成DNA損傷,細(xì)胞核完整。注射血管支架浸提液的SD大鼠的體溫升高值低于0.2℃,表明浸提液不含致熱源物質(zhì),植入動物體內(nèi)后其無熱源作用。經(jīng)支架浸提液處理的間充質(zhì)干細(xì)胞的染色體畸變率均5%,符合生物安全要求。注射血管支架浸提液后,昆明小鼠PCE的微核率為3.1±1.5‰,無致畸性,表明支架浸提液不會造成細(xì)胞DNA損傷。血管支架的溶血率僅為1.5%,符合IS010993小于5%的要求；復(fù)鈣化凝血時間和動態(tài)凝血時間實驗結(jié)果證實其具有良好的抗凝血性能,且與(PCL/CS)/(PCL/Gt)相比在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異；血管支架上黏附的血小板極少,P-選擇素表達(dá)量僅為0.389,其吸附蛋白的量明顯低于(PCL/CS)/(PCL/Gt)。在浸入新鮮血液中后,12h內(nèi)血管支架管腔持續(xù)通暢,無血栓出現(xiàn)。對血管支架進(jìn)行生理鹽水溶液浸提,在浸提25d內(nèi),其抗凝血性能始終良好。作為血管組織工程支架材料,雙層蛛絲蛋白血管支架具有良好的血液相容性。 四、優(yōu)化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分離及向內(nèi)皮細(xì)胞分化的方法,研究干細(xì)胞的生物學(xué)特性。MSc多呈梭形和星形,細(xì)胞形態(tài)均一,細(xì)胞生長旺盛。分離自骨髓的MSC的CD105和CD90因子的表達(dá)率分別為82.54%和94.98%,而CD45因子的表達(dá)率僅為7.32%。第4代MSC多呈梭形,細(xì)胞呈團(tuán)聚分布,增殖能力強(qiáng),增殖指數(shù)達(dá)到20.31%,潛伏期短,自第2天就進(jìn)入對數(shù)生長期；第8代MSC的增殖能力顯著減弱,增殖指數(shù)僅為9.24%,細(xì)胞形狀呈現(xiàn)不規(guī)則狀,胞體變大,有老化現(xiàn)象。第2代和第4代MSC凍存復(fù)蘇后的存活率均高于80%,第8代MSC的存活率大約為60%。MSC在誘導(dǎo)5d時CD31即有較弱表達(dá),隨著誘導(dǎo)時間的延長,表達(dá)隨之增強(qiáng)。誘導(dǎo)10天后,所有代數(shù)的MSc均表達(dá)CD31,但是第2代、第4代和第6代MSC表達(dá)CD31的陽性率與第8代相比有差異。在4h時,不同代數(shù)的MSC在雙層蛛絲蛋白血管支架上有了不同程度的黏附,第6代之前的干細(xì)胞的黏附率皆在40%左右,然而第8代干細(xì)胞的黏附率為27%。 五、評價雙層蛛絲蛋白血管支架的細(xì)胞相容性與組織相容性,探討信號通路在血管支架與干細(xì)胞相互作用過程中的作用機(jī)制。在血管支架浸提液培養(yǎng)條件下的大鼠骨髓MSC集落生成率、平均集落面積和分裂指數(shù)都顯著高于對照組。血管支架毒性等級均低于1級,無細(xì)胞毒性。與血管支架浸提液復(fù)合培養(yǎng)的MSC生長狀態(tài)良好,臺盼藍(lán)拒染率高于95%,復(fù)合培養(yǎng)48h后,細(xì)胞G0/1期比例降低,S、G2/M期比例均升高。MSC在血管支架上能良好地黏附生長,增殖旺盛,能夠遷移到血管支架內(nèi)部。Notch信號通路對干細(xì)胞在雙層蛛絲蛋白血管支架上的增殖起著重要的作用,pNSR16與Notch信號通路有相互作用關(guān)系,pNSR16有可能是Notch受體的配體結(jié)構(gòu)類似物,起著配體作用。而不含有RGD三肽的膠原蛋白與Notch信號通路無相互作用關(guān)系,由此認(rèn)為pNSRl6中的RGD序列能有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖。與血管支架復(fù)合培養(yǎng)的MSC中Notch信號通路下游基因Hesl的表達(dá)量高于對照組,且第6代MSCHesl基因表達(dá)比值低于第4代。血管支架皮下植入2周后,血管支架上的炎性細(xì)胞數(shù)量少于對照組,不會誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。雙層蛛絲蛋白血管支架的組織相容性優(yōu)于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,且前者的降解速度快于后者。 六、應(yīng)用動態(tài)培養(yǎng)的方法將間充質(zhì)干細(xì)胞和雙層蛛絲蛋白血管支架復(fù)合培養(yǎng)構(gòu)建小直徑組織工程血管。培養(yǎng)7天后,細(xì)胞和支架表面結(jié)合緊密,細(xì)胞在納米纖維支架上充分鋪展,并且可以遷移到血管支架纖維內(nèi)部生長,細(xì)胞與血管支架纖維表現(xiàn)出很好的相容性,與材料融合成為三維細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),且將材料纖維大部分包埋,形成了組織工程血管。組織工程血管的縫合強(qiáng)度為0.95±0.12N,是天然血管的29.6%。隨著時間的持續(xù),組織工程血管中的羥脯氨酸含量和DNA含量不斷增加,羥脯氨酸含量在第14天和第28天分別達(dá)到0.16ug/mg和0.2ug/mg,且與對照組相比在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。 七、探討組織工程血管修復(fù)SD大鼠腹主動脈缺損的效果。在移植手術(shù)期間,重新恢復(fù)血流時組織工程血管以及吻合口均未出現(xiàn)滲血漏血現(xiàn)象,置換后可觀察到血管搏動良好。術(shù)后動物恢復(fù)良好,未見發(fā)炎現(xiàn)象。體重為350-450g的SD大鼠腹動脈管徑與人體主要冠狀動脈(LAD中遠(yuǎn)段)相比無明顯差別。經(jīng)血液生理生化指標(biāo)分析,證實該組織工程血管對肝腎無明顯毒性作用。在移植體內(nèi)12周后組織工程血管的斷裂強(qiáng)度為3.4MPa,相對于移植前的強(qiáng)度(6.1MPa)有所降低,但仍然高于天然血管的斷裂強(qiáng)度,說明小直徑組織工程血管在體內(nèi)組織液環(huán)境中能保持一定程度的力學(xué)強(qiáng)度。在12周的移植期內(nèi)膠原蛋白的合成與分泌不斷增加,羥脯氨酸的相對含量在2周時約為12.5%,在12周時增加到46.7%。12周后移植血管內(nèi)壁覆蓋有較多的細(xì)胞。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了雙層蛛絲蛋白血管支架,其具有良好的抗熱性、親水性、血液相容性、生物力學(xué)性能、適宜的降解性能和生物安全性。優(yōu)化了大鼠骨髓MSC的分離方法,分離的MSC增殖性良好,在體外培養(yǎng)條件下不同代數(shù)的MSC的生物學(xué)性能有一定的差異。MSC與雙層蛛絲蛋白血管支架的細(xì)胞相容性良好,蛛絲蛋白可能是與Notch信號通路的Notch受體相互作用,促進(jìn)下游基因Hesl的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞的增殖。應(yīng)用動態(tài)培養(yǎng)的方式構(gòu)建了小直徑組織工程血管,并應(yīng)用于SD大鼠腹主動脈的缺損修復(fù),12周的移植期內(nèi)無血栓,大鼠身體狀況良好,表明小直徑組織工程血管應(yīng)用于臨床具有一定的可行性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2296115