【摘要】：摘要：基因治療是惡性腫瘤等重大疾病治療的最新策略,基因載體是基因治療的關鍵技術之一,但現(xiàn)有的病毒型載體安全性和非病毒型載體低效率嚴重制約了其臨床應用。羥基磷灰石(HAP)是人體骨骼的主要成分,具有天然的生物相容性,與蛋白和基因有高親和性,且HAP納米顆粒本身對癌細胞具有抑制性能。前期研究顯示HAP納米顆粒是一種極具應用潛力的基因載體材料,但需要進一步提高其基因轉染效能,并闡明其細胞轉導機制及其與載體微結構之間的關系。 本論文選擇了一種水熱合成法制備的稀土金屬摻雜的精氨酸表面修飾羥基磷灰石(HAP/Arg)納米顆粒為研究對象,闡明HAP/Arg納米顆粒的基因負載與釋放機理,并將其作用于體外培養(yǎng)的人正常血管內(nèi)皮細胞和人腫瘤細胞Hela細胞,考察HAP/Arg納米顆粒的負載基因的轉染活性和生物安全性,實時觀察HAP/Arg納米顆粒的跨膜轉運入胞過程,并闡釋與細胞相互作用的入胞機制。主要內(nèi)容及結論歸納如下： 1)以HAP納米顆粒液相可控合成及其功能化研究為基礎,水熱法制備了結晶程度比較高、晶形完整的HAP/Arg納米顆粒。研究發(fā)現(xiàn),精氨酸修飾的HAP納米顆粒與沒添加精氨酸合成的HAP納米顆粒在結構上基本一致。但精氨酸的加入在一定程度上抑制了HAP納米顆粒的生長速率,與沒添加精氨酸合成的HAP納米顆粒相比,其長徑比有所減小,呈短棒狀,表面電荷由荷負電轉為荷正電。從而為提高HAP納米顆粒的基因轉染效能奠定了基礎。其次,少量稀土離子Eu或Tb摻雜不影響合成的HAP/Arg納米顆粒產(chǎn)物的結構,均為單一的HAP納米顆粒物相,在相應可見光波段范圍內(nèi)均有發(fā)射特征峰,激發(fā)后分別可發(fā)出較強的特征紅光和綠光,從而使HAP/Arg納米顆粒具有發(fā)射熒光性能。 2)闡明了HAP/Arg納米顆粒的基因負載與釋放機理。結果表明,荷正電的HAP/Arg納米顆粒與帶負電荷的質粒DNA通過靜電結合能快速形成HAP/Arg-DNA復合物,且30μg的HAP/Arg納米顆粒至少能結合1μg DNA。同時,HAP/Arg納米顆粒對結合的DNA有明顯的保護作用,可免受人體血漿蛋白成分或核酸酶的破壞,從而提高了其轉載DNA的體內(nèi)穩(wěn)定性,為體內(nèi)基因轉染創(chuàng)造了良好條件。 3)考察了HAP/Arg納米顆粒的體外細胞轉染活性和生物安全性。研究發(fā)現(xiàn),HAP/Arg-DNA復合物可以有效轉染Hela細胞,而未經(jīng)精氨酸修飾的HAP納米顆粒不能有效轉載質粒DNA,對Hela細胞的轉染效率極低。HAP/Arg納米顆粒各劑量組在不同作用時間下對所選擇的人正常血管內(nèi)皮細胞(HAEC)和人腫瘤細胞(Hela)的正常生長和細胞膜結構均無明顯影響。動物的急性毒性實驗和生殖毒性實驗表明,HAP/Arg納米顆粒各劑量組與對照組相比均無顯著差異。以上結果為下一步構建一種能高效、安全、簡便的新型納米基因轉導系統(tǒng)打下基礎。 4)實時觀察HAP/Arg納米顆粒的跨膜轉運入胞過程,并闡釋了其內(nèi)吞入胞作用機制。研究表明,鋱摻雜的HAP/Arg納米顆粒被人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)攝取后主要存在于細胞質中,而且大部分分布在細胞核區(qū)域周圍。并且,HAP/Arg納米顆粒的入胞過程具有時間和濃度依賴性,作用時間以4h為宜,納米顆粒的濃度以50μg/mL為最佳。入胞競爭實驗結果也表明精氨酸修飾的HAP納米顆粒入胞量明顯強于未經(jīng)精氨酸修飾的HAP納米顆粒,這很可能與精氨酸及其胍基官能團的作用有關。內(nèi)吞抑制試驗結果表明HAP/Arg納米顆粒進入HUVEC細胞是一個主動轉運的能量依賴的過程,并為網(wǎng)格蛋白和小凹蛋白介導內(nèi)吞相結合的細胞跨膜轉運機制,但以小凹蛋白介導內(nèi)吞途徑為主。
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【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

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1 黃蘇萍;朱軍;孫虹;周科朝;;無機納米基因載體的研究進展[J];材料導報;2010年15期

2 趙欣;王德平;;納米羥基磷灰石作為藥物載體材料的研究進展[J];材料導報;2010年23期

3 龐曉峰;曾紅娟;;納米羥基磷灰石粉體的生物活性的研究[J];材料工程;2009年04期

4 王永峰;靳安民;魏坤;王旭東;湯善華;閔少雄;;抗感染納米羥基磷灰石局部藥物緩釋微球的研制及體外釋藥實驗[J];南方醫(yī)科大學學報;2006年06期

5 吳雄輝;孫虹;邢曉為;黃利華;黃蘇萍;;納米羥基磷灰石表面修飾及其DNA結合性能的實驗研究[J];南方醫(yī)科大學學報;2010年10期

6 蔡明輝;趙葵;展永;倪嵋楠;隋麗;孔福全;楊明建;;AFM的DNA樣品制備技術研究[J];電子顯微學報;2006年01期

7 曹獻英,李世普,任衛(wèi),江昕,王友法,閆玉華;納米羥基磷灰石的表征及其對肝癌抑制作用的研究[J];硅酸鹽通報;2003年04期

8 鄭志雯;劉小健;趙娜如;王迎軍;魏坤;張淑花;;層狀納米羥基磷灰石/茶氨酸藥物釋藥性能研究[J];硅酸鹽通報;2012年02期

9 王巖;肖艷;郎美東;;表面改性對羥基磷灰石蛋白吸附的影響[J];華東理工大學學報(自然科學版);2011年05期

10 劉軍安;魏曉磊;江洪;鐘文忠;;新型改性PAMAM樹狀大分子的合成及其轉染效率初探[J];華中農(nóng)業(yè)大學學報;2010年03期

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1 朱敦皖;殼聚糖衍生物非病毒基因載體的研究[D];天津大學;2008年

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本文編號：2285137