【摘要】：研究背景 組織工程技術(shù)是近來學術(shù)界研究熱點,細胞療法和基因療法是組織工程研究的熱點,學術(shù)界一直探求一種臨床實用性強的安全的輔助組織工程手段。 近年來,隨著脂肪抽吸術(shù)的廣泛開展和應用,自體脂肪顆粒注射移植術(shù)已經(jīng)在國內(nèi)外得到廣泛的重視。自體脂肪顆粒以其無排斥、感染率低、注射后組織相容性好等優(yōu)點,是目前修復軟組織缺損比較理性的填充材料。雖然脂肪組織工程技術(shù)理論的發(fā)展,為真正實現(xiàn)無損傷修復軟組織缺損和真正意義上形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能重建開辟了新的途徑。但是,脂肪組織工程技術(shù)目前還不能實現(xiàn)臨床應用,所以目前修復軟組織缺損較理想的填充材料是自體脂肪顆粒。 自體脂肪顆粒移植在臨床上一直備受關注,尤其是負壓抽脂術(shù)在臨床上得到廣泛的應用之后,這種移植術(shù)被越來越多的臨床醫(yī)生和患者所接受,并在獲取、純化、注射脂肪和提高其存活率等方面不斷得到提高。但是,自體脂肪顆粒移植后吸收率可高達30%-50%,這種高吸收率的問題一直不能得到良好的解決,所以移植脂肪成活率較低極大地限制了其在臨床上的廣泛應用。脂肪組織不僅是儲存能量及內(nèi)分泌器官,還是軟組織填充理想的替代物,而且還被認為是成體干細胞的有效來源,因為脂肪組織當中含有多種細胞成分,包括祖細胞成分,這些祖細胞成分可分化成為其他細胞系。脂肪組織當中主要包含脂肪細胞、脂肪干細胞、血管內(nèi)皮細胞、壁細胞、成纖維細胞、巨噬細胞及細胞外基質(zhì)成分等,其中脂肪細胞和脂肪干細胞是近年來研究的熱點。脂肪干細胞被認為是一種表現(xiàn)脂肪細胞和血管細胞的祖細胞,它位于脂肪細胞之間、血管周圍或細胞外基質(zhì)中,可促進脂肪組織的轉(zhuǎn)歸。脂肪干細胞存在于脂肪組織的間質(zhì)血管碎片中(stromal vascular fraction,SVF),而SVF是干細胞輔助脂肪移植中最重要的組分。通過膠原酶消化,從脂肪組織中分離的多種細胞混合物形成的細胞團就叫做間質(zhì)血管碎片(SVF)。間質(zhì)血管碎片中含有豐富的間充質(zhì)干細胞,可分化為多種譜系,是再生醫(yī)學、組織工程等最理想的種子細胞。 選擇合適細胞外基質(zhì)支架,作為妥當?shù)募毎d體是組織工程的關鍵,是使SVFs中的ADSCs得以增殖、分化的重要條件。脂肪組織本身含有非常豐富的膠原、蛋白聚糖、纖維粘連蛋白等,這些組織是優(yōu)秀的細胞外基質(zhì)。這些年來熱門的SVFs細胞輔助脂肪轉(zhuǎn)移技術(shù),既解決了移植脂肪中ADSCs含量低,同時又解決了移植的SVFs缺乏細胞外基質(zhì)兩個問題,并簡化了SVFs提取的體外培養(yǎng)、多次離心重懸等步驟,為臨床上解決移植脂肪吸收率高的難題提供了一種解決方法。 在組織工程材料中加入有活性的生長因子,能夠增強工程化組織的血管化,減少吸收率,提高移植組織的成活。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)又稱為血管滲透因子,這種細胞因子具有促進血管滲透的作用,同時還可促進血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移、延長血管內(nèi)皮細胞壽命、促進血管形成、增強血管通透性和改變細胞外基質(zhì)等作用。除了對血管的作用,它還與創(chuàng)面愈合、創(chuàng)傷組織修復、炎癥和腫瘤發(fā)生密切相關。VEGF與VEGF受體之間存在正反饋,VEGF因子局部應用可以誘導血管內(nèi)皮細胞VEGF及其受體的高表達,導致VEGF效應的放大。但是VEGF在體內(nèi)應用時因其半衰期短、容易降解等因素使得不能充分發(fā)揮其生物學效應。藥劑學的緩釋技術(shù)很好的解決這一難題,它通過微球包埋技術(shù)將VEGF包埋于聚乳酸納米微球中,從而使這種細胞因子能夠緩慢的釋放,達到對周圍環(huán)境持續(xù)發(fā)揮生物學效應的目的。這種緩釋技術(shù)在脂肪組織工程的研究領域具有很大的研究價值。 近年來,組織工程技術(shù)的發(fā)展迅速,使得很多臨床上的難題獲得了一種可能性的解決方案。然而,由于組織工程的血管化問題難以解決,大部分的組織工程技術(shù)距離臨床應用還有很大距離。膠原蛋白是良好的支架材料,其已被美國FDA批準作為人工皮膚材料。對于種子細胞的選擇,大部分研究都選擇脂肪干細胞。然而由于脂肪干細胞需要培養(yǎng)周期,且操作復雜,臨床應用性不強。SVFs作為種子細胞,具有很多優(yōu)勢。以膠原蛋白作為支架材料,以SVFs作為種子細胞構(gòu)建工程化的脂肪組織,并且以VEGF-PLA緩釋微球作為微環(huán)境細胞因子,國內(nèi)外尚未見相關報道。 研究目的 1.臨床指導上：希望通過探討VEGF-PLA納米緩釋微球與SVFs對游離移植脂肪顆粒及脂肪組織工程膠原支架血管化的影響。探索一種臨床應用性強的輔助脂肪移植和脂肪組織工程的細胞療法和基因療法手段。為下一步將科學研究應用于臨床做好理論基礎。 2.學術(shù)上：基因療法的細胞因子緩釋系統(tǒng)結(jié)合SVFs細胞療法對游離脂肪移植及組織工程膠原支架血管化的研究,在國內(nèi)外學術(shù)界尚未見報道。本研究希望通過對其機理的探討,進一步揭示其機理,為臨床應用做鋪墊。 本研究的創(chuàng)新點是,將SVFs與細胞因子緩釋系統(tǒng)相結(jié)合,聯(lián)合SVFs和(或)VEGF-PLA緩釋微球體內(nèi)構(gòu)建工程化脂肪組織及輔助脂肪移植。同類的研究在學術(shù)界尚未見報道。具體的研究目的如下。 1.利用酶消化法從人脂肪組織當中分離提取SVFs,進行形態(tài)觀察,并進行多向誘導分化,探討其干細胞特性及作為脂肪組織工程理想種子細胞的優(yōu)勢。 2.體外DiI熒光標記SVFs,熒光顯微鏡觀察細胞標記情況并檢測DiI標記對SVFs培養(yǎng)貼壁所得PO代細胞增殖和成脂分化的影響,探討DiI標記作為細胞示蹤標記的優(yōu)勢。 3.體外構(gòu)建VEGF-PLA聚乳酸納米微球緩釋系統(tǒng),檢測樣品包封率和載藥量,并檢測其體外緩釋能力,探討其應用于輔助脂肪顆粒移植研究的可行性。 4.設計對照組,將SVFs和(或)VEGF-PLA緩釋微球聯(lián)合脂肪顆粒移植進行體內(nèi)實驗,探討SVFs和(或)VEGF-PLA緩釋微球?qū)︙w內(nèi)脂肪顆粒移植成活的影響。 5.以Ⅰ型膠原固態(tài)支架為載體材料,聯(lián)合SVFs和(或)VEGF-PLA緩釋微球體內(nèi)構(gòu)建工程化脂肪組織的影響,檢測其體內(nèi)構(gòu)建脂肪組織的血管化水平,為脂肪組織工程提供實驗依據(jù)。 材料與方法 1.SVFs的體外分離培養(yǎng)及其培養(yǎng)所得未傳代P0代細胞多向誘導分化鑒定 收集抽脂術(shù)患者的脂肪組織,純化后用Ⅰ型膠原酶消化、過濾、離心、鋪皿進行貼壁培養(yǎng),觀察細胞生長狀態(tài)。用MTT法繪制細胞增殖生長曲線;用相應的定向誘導液對SVFs培養(yǎng)所得未傳代PO代細胞向脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞方向誘導分化,并用油紅O、茜素紅和阿新藍染色進行鑒定。 2. SVFs體外DiI熒光標記及觀察標記物對SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細胞生物性狀的影響 熒光染料DiI體外標記SVFs,倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細胞生長情況,分別用MTT法和油紅O定量檢測法檢測DiI標記后SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細胞增殖能力和成脂分化能力,并與未標記組進行統(tǒng)計學比較,分析標記后細胞生物性狀的改變。 3.體外構(gòu)建VEGF-PLA緩釋微球并檢測其載藥量、包封率及體外緩釋特性 體外用超聲乳化法構(gòu)建VEGF-PLA緩釋微球,檢測微球載藥量和包封率；透射電鏡觀察微球包被情況并測量直徑；用ELISA試劑盒檢測VEGF-PLA緩釋能力,連續(xù)檢測21d,分析緩釋微球的特性,為下一步實驗提供依據(jù)。 4.SVFs及VEGF-PLA緩釋微球?qū)χ绢w粒移植影響的體內(nèi)實驗研究 分組設計：第1組移植單純脂肪顆粒；第2組移植脂肪顆粒+SVFs,第3組移植脂肪顆粒+SVFs+VEGF-PLA緩釋微球；體外將SVFs用DiI熒光標記,標記后分別按照分組將SVFs和(或)VEGF-PLA緩釋微球與脂肪顆�；靹�,觀察混勻后的性狀,無菌條件下將混合物通過注射的方式隨機注射入裸鼠皮下,每只裸鼠注射3個點。8w后取出移植物,準確測量濕重,記錄數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計學比較,組織切片經(jīng)HE和CD34及VEGF免疫組化染色分析,觀察移植后脂肪顆粒存活情況,并觀察CD34和VEGF的表達情況,顯微鏡下計數(shù)三組毛細血管數(shù)量,并進行統(tǒng)計學比較,分析SVFs和VEGF-PLA緩釋微球?qū)σ浦参镅芑挠绊憽?5.VEGF-PLA緩釋微球促進工程化脂肪組織血管化的影響研究 準備三組移植物,1組為SVFs+膠原支架,未體外成脂誘導。2組為SVFs+膠原支架,3組為SVFs+膠原支架+VEGF-PLA緩釋微球,2組和3組體外成脂誘導3天后進行裸鼠體內(nèi)移植,三組移植同一只裸鼠皮下；分別于4w后取出新生標本,通過大體觀察、測量濕重、HE染色觀察新生組織結(jié)構(gòu)和血管生長情況,高倍鏡下計數(shù)新生毛細血管密度,收集數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計學比較分析。 統(tǒng)計學處理 所得數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件包進行統(tǒng)計分析,以均數(shù)±標準差(x±s)表示。P0.05差異有統(tǒng)計學差異。SVFs培養(yǎng)貼壁生長曲線(OD值)采用曲線擬合方法分析。DiI標記對細胞增殖能力影響采用重復測量的方差分析。DiI標記后對SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細胞成脂能力影響采用獨立樣本T檢驗。透射電鏡和圓二色譜法測緩釋微球直徑的比較采用獨立樣本T檢驗。體內(nèi)脂肪移植物濕重比較采用單因素方差分析。體內(nèi)脂肪移植物血管數(shù)比較采用單因素方差分析。組織工程新生物濕重比較采用單因素方差分析。組織工程新生物血管數(shù)比較比較采用單因素方差分析。結(jié)果 1.從抽脂術(shù)患者得到的脂肪組織當中成功分離得到SVFs,貼壁生長后形態(tài)類似于成纖維細胞,具有很強的分裂增殖能力,3至7天時細胞增殖快速。對所測的OD值進行曲線擬合方法分析,用Quadratic模型,R2=0.965,回歸方程檢驗有統(tǒng)計學意義(F=503.047,P=0.000)。用成脂、成骨、成軟骨定向分化誘導液誘導2～3周后,分別用油紅O、茜素紅、阿新藍染色呈陽性反應。 2.體外用DiI成功標記SVFs,標記后細胞呈現(xiàn)較強的紅色熒光,標記率較高,標記后細胞成活率較高,達(92.31±1.52)%。與正常的SVFs成活率(92.73±0.57)%并無差異。兩組進行獨立樣本T檢驗。經(jīng)方差齊性分析,兩組樣本的方差不齊(F=5.396,P=0.043)。兩個樣本之間的均值差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.631,P=0.550),DiI標記對SVF細胞成活率無影響。 對OD值進行重復測量分析。Mauchly's Test of sphericity檢驗Mauchly'sW為0.001,P=0.018,7次測量的OD值存在相關性。Test of within subjects Effects(Greenhouse-Geisser校正)見時間因素P=0.000。時間和分組作用P=0.524,F=0.693。可見時間因素的作用有統(tǒng)計學意義,測量指標有隨時間變化而變化的趨勢,而時間因素的作用不受分組因素影響。Test of Between-Subjects Effects分組作用的F=0.062,P=0.810,可見分組因素不起作用,兩組無區(qū)別。每個檢測點DiI標記組和未標記組OD值差異無統(tǒng)計學意義(每個點P0.05詳見表2-2)。重復測量分析兩組OD均數(shù)變化趨勢,2組幾乎重疊(詳見圖2-3)以上的分析結(jié)果可見DiI標記對SVFs貼壁培養(yǎng)的PO代細胞增值能力無影響。DiI標記后對SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細胞成脂能力也沒有太大的影響,兩組進行獨立樣本T檢驗。經(jīng)方差齊性分析,兩組樣本的方差齊(F=0.794,P=0.399)。兩個樣本之間的均值差異無統(tǒng)計學意義(t＝1.562,P=0.157),DiI標記對SVF細胞成活率無影響。 3.體外成功構(gòu)建VEGF-PLA緩釋微球,微球表面光滑、球體大小均勻、形態(tài)飽滿；微球直徑平均為(27.56±4.60)nm；微球樣品包封率為(89.24±1.24)%,計算樣品的載藥量為：{(17.85±0.25)×10-3}%；通過ELISA方法檢測微球緩釋特性,21d內(nèi)微球可緩慢釋放VEGF,第21d累計釋藥率為80.35%。將微球稀釋后在透射電鏡下測量其直徑為(28.30±4.64)nm。與利用圓二色譜法測量微球直徑法比較。兩組進行獨立樣本T檢驗。經(jīng)方差齊性分析,兩組樣本的方差齊(F=0.033,P=0.860)。兩個樣本之間的均值差異無統(tǒng)計學意義(t=0.253,P=0.253),兩種測量方法無差異。 4.將3組混合物移植裸鼠體內(nèi)8w后,裸鼠全部成活,移植物清晰可見。1組、2組和3組平均濕重分別為：(0.077±0.119)g；(0.159±0.016)g；(0.182±0.120)g。3組數(shù)據(jù)方差齊性檢驗,P=0.946,方差具有齊性。3組數(shù)據(jù)有顯著性差異,3組間比較,F=167.678,P=0.000,3組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義。第3組濕重高于第2組(P=0.001)。第2組濕重高于第1組(P=0.000)組織切片HE染色顯示第3組脂肪細胞成活率最高,纖維性成分最少,第2組次之,第1組內(nèi)部纖維性成分最多；免疫組化結(jié)果同樣是第3組表達最強,第2組次之,第1組最少。血管密度計數(shù)經(jīng)統(tǒng)計學比較分析,第1、2、3組平均新生血管數(shù)量分別為：(7.25±1.83)個/HP;(12.65±1.69)個/HP；(14.75±2.02)個/HP；3組數(shù)據(jù)方差齊性檢驗,Levene statistic為0.256,P=0.775,方差具有齊性。組間比較,F=87.048,P=0.000,3組數(shù)據(jù)有顯著性差異。第3組血管數(shù)多于第2組(P=0.000)。第2組血管數(shù)多于第1組(P=0.001)。 5.三組移植物移植裸鼠體內(nèi)4w后,動物全部成活,第2組和第3組成功構(gòu)建出脂肪組織。新生物濕重測定,術(shù)后4w時三組濕重分別為：(23.28±3.86)mg,(31.16±2.19)mg,(36.67±1.60)mg,運用SPSS軟件進行單因素方差分析,首先進行方差齊性檢驗,Levene statistic為3.044,P=0.069,方差具有齊性。三組濕重比較,差異具有顯著性(F=48.768,P=0.000)。1組比2組輕,差異具有顯著性(P=0.000)。2組比3組輕,差異具有顯著性(P=0.001)。4w時第1組、2組和3組新生毛細血管密度平均分別為(1.81±0.83)個/HP,(2.62±0.89)個／HP,(3.44±1.09)個/HP。Levene statistic檢驗,方差具有齊性(P=0.318)。Levene statistic為1.177,方差具有齊性(P=0.318)。三組比較F=11.846,差異具有顯著性(P=0.000)。1組比2組血管少,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.019)。2組比3組血管少,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.019)。可見VEGF-PLA緩釋微球聯(lián)合SVFs能夠明顯促進膠原支架體內(nèi)成脂和血管化水平。 結(jié)論 1.抽脂術(shù)獲得的脂肪組織能夠成功分離提取大量的多能干細胞,經(jīng)形態(tài)學、及多向分化鑒定證實為干細胞成分。該細胞容易獲取、來源豐富、在相應的誘導條件下能夠分化成為目的細胞,可作為脂肪組織工程理想的種子細胞。 2.DiI標記是一種較好的細胞示蹤方式,標記后細胞成活率較高,不會影響SVFs培養(yǎng)所得未傳代P0代細胞的增殖和成脂分化的能力。 3.將VEGF包被于PLA微球中,可以使微球中VEGF緩慢釋放進入局部微環(huán)境,從而達到VEGF對周圍細胞持續(xù)發(fā)揮作用的目的。 4. SVFs和VEGF-PLA緩釋微球體內(nèi)能夠明顯促進脂肪顆粒的成活率,同樣能夠明顯促進脂肪顆粒移植血管化的水平,是一種輔助脂肪顆粒移植理想的種子細胞和細胞因子緩釋劑。 5.VEGF-PLA緩釋微球聯(lián)合SVFs體內(nèi)能夠明顯促進新生組織的血管化,與膠原支架混合移植能夠構(gòu)建出成熟的脂肪組織。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R318.1

【參考文獻】

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1 李梅,劉敏,王欣,廖志鋼;血管內(nèi)皮細胞生長因子在法醫(yī)學中的應用[J];法醫(yī)學雜志;2001年04期

2 沈誠,范士志;血管內(nèi)皮細胞生長因子及臨床應用策略[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);2003年01期

3 王玉麗;膠原在生物醫(yī)學中的應用[J];國外醫(yī)學.藥學分冊;2002年02期

4 雷華,李青峰;離心對脂肪顆�；钚杂绊懙难芯縖J];中國美容醫(yī)學;2005年01期

5 鄭丹寧,雷華,李青峰;多種生長因子及DMEM培養(yǎng)液對植入脂肪成活率影響的研究[J];中國美容醫(yī)學;2005年01期

6 梁杰;銀桂彬;彭智;羅少軍;;血管生成素協(xié)同血管內(nèi)皮細胞生長因子對自體脂肪移植血運重建的影響[J];中國美容醫(yī)學;2007年07期

7 王珍;羅靜聰;楊志明;;組織工程化血管相關生長因子的研究[J];中國臨床康復;2006年01期

8 孫慶仲 ,閆紅艷 ,李正維 ,孫慶智;自體顆粒脂肪移植術(shù)的進展[J];中華醫(yī)學美學美容雜志;2002年06期

9 戚可名;張晶;;顆粒脂肪注射移植操作體會[J];中華整形燒傷外科雜志;1994年06期

10 杜學亮,羅少軍,郝新光,湯少明,梁杰;堿性成纖維細胞生長因子在顆粒脂肪移植后血運重建過程的作用[J];中華整形外科雜志;2005年02期

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本文編號：2284350