【摘要】：目的：探討攜帶重組人胰島素基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)與絲素蛋白支架在體內(nèi)外構(gòu)建組織工程化脂肪的可行性。 方法：1.以最適MOI=10重組慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染hUCMSCs(A組),EGFP基因轉(zhuǎn)染組(B組)作為對(duì)照；將兩組細(xì)胞接種于絲素蛋白支架,熒光倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)及黏附情況；爾后行細(xì)胞-支架復(fù)合物成脂誘導(dǎo),5-7d后,油紅O染色、RT-PCR檢測(cè)觀察成脂情況。2.四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)重組慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染對(duì)hUCMSCs生長(zhǎng)增殖的影響,分為轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。3.MTT法測(cè)定基因轉(zhuǎn)染的hUCMSCs在絲素蛋白支架上的活性,分為細(xì)胞組與細(xì)胞支架組。4.將攜帶重組人胰島素基因慢病毒載體以最適MOI=10轉(zhuǎn)染hUCMSCs,將轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)的hUCMSCs分別接種于絲素蛋白支架,在體外含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基中孵育1-2d,在成脂誘導(dǎo)劑中孵育5-7d后,移植于Wistar大鼠背部皮下；移植后12周取材,行熒光原位雜交技術(shù)鑒定與組織形態(tài)學(xué)和掃描電鏡觀察。 結(jié)果：1.A、B兩組細(xì)胞-支架復(fù)合物成脂誘導(dǎo)5-7d后,掃描電鏡見細(xì)胞與支架黏附良好并有大量基質(zhì)分泌,油紅O染色見絲素蛋白支架內(nèi)已有脂肪樣細(xì)胞生成,并與絲素蛋白支架牢固粘附,A組脂肪樣細(xì)胞數(shù)量明顯多于B組,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.007, P0.01); RT-PCR檢測(cè)證實(shí)經(jīng)誘導(dǎo)的A、B組hUCMSCs均表達(dá)成脂特異性基因PPARy-2,且A組PPARy-2基因表達(dá)更強(qiáng)于B組,而未經(jīng)誘導(dǎo)的hUCMSCs(陰性對(duì)照)表達(dá)為陰性。2.MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染重組慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP的hUCMSCs與未轉(zhuǎn)染組各時(shí)間點(diǎn)D值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056,P0.05),說明以攜帶重組人胰島素基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染hUCMSCs對(duì)其生長(zhǎng)增殖無明顯影響。3.細(xì)胞組與細(xì)胞支架組D值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.066,P0.05),表示絲素蛋白支架對(duì)基因轉(zhuǎn)染后的hUCMSCs的生長(zhǎng)活性無明顯影響。4.油紅O染色顯示,兩組移植物均呈陽性,證明移植物已在體內(nèi)分化為脂肪組織,且轉(zhuǎn)染組脂肪樣細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組,有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.01)；HE染色顯示,兩組移植物組織結(jié)構(gòu)與正常脂肪組織相似,組織內(nèi)及其周圍可見明顯新生血管,未降解支架材料周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),轉(zhuǎn)染組支架材料降解明顯,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于對(duì)照組,新生血管數(shù)量也多于對(duì)照組；掃描電鏡觀察提示,兩組移植物內(nèi)可見脂肪樣細(xì)胞和新生血管,轉(zhuǎn)染組移植物內(nèi)脂肪樣細(xì)胞聚集成團(tuán),其結(jié)構(gòu)與正常脂肪組織相似,而對(duì)照組脂肪樣細(xì)胞散在分布于支架孔隙內(nèi)。 結(jié)論：1.胰島素基因能明顯促進(jìn)hUCMSCs成脂肪化,攜帶重組人胰島素基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染的hUCMSCs能有效地與絲素蛋白支架在體外構(gòu)建組織工程化脂肪。2.攜帶重組人胰島素基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染的hUCMSCs與絲素蛋白支架復(fù)合后,在Wistar大鼠體內(nèi)能構(gòu)建出組織工程化脂肪組織,其結(jié)構(gòu)類似正常脂肪組織。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R318.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2263699