【摘要】：目的：探討攜帶重組人胰島素基因慢病毒載體轉染的臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)與絲素蛋白支架在體內外構建組織工程化脂肪的可行性。 方法：1.以最適MOI=10重組慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP轉染hUCMSCs(A組),EGFP基因轉染組(B組)作為對照；將兩組細胞接種于絲素蛋白支架,熒光倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察細胞在支架上的生長及黏附情況；爾后行細胞-支架復合物成脂誘導,5-7d后,油紅O染色、RT-PCR檢測觀察成脂情況。2.四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測重組慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP轉染對hUCMSCs生長增殖的影響,分為轉染組和未轉染組。3.MTT法測定基因轉染的hUCMSCs在絲素蛋白支架上的活性,分為細胞組與細胞支架組。4.將攜帶重組人胰島素基因慢病毒載體以最適MOI=10轉染hUCMSCs,將轉染組與未轉染組(對照組)的hUCMSCs分別接種于絲素蛋白支架,在體外含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基中孵育1-2d,在成脂誘導劑中孵育5-7d后,移植于Wistar大鼠背部皮下；移植后12周取材,行熒光原位雜交技術鑒定與組織形態(tài)學和掃描電鏡觀察。 結果：1.A、B兩組細胞-支架復合物成脂誘導5-7d后,掃描電鏡見細胞與支架黏附良好并有大量基質分泌,油紅O染色見絲素蛋白支架內已有脂肪樣細胞生成,并與絲素蛋白支架牢固粘附,A組脂肪樣細胞數量明顯多于B組,有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.007, P0.01); RT-PCR檢測證實經誘導的A、B組hUCMSCs均表達成脂特異性基因PPARy-2,且A組PPARy-2基因表達更強于B組,而未經誘導的hUCMSCs(陰性對照)表達為陰性。2.MTT法檢測結果顯示,轉染重組慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP的hUCMSCs與未轉染組各時間點D值比較差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.056,P0.05),說明以攜帶重組人胰島素基因的慢病毒載體轉染hUCMSCs對其生長增殖無明顯影響。3.細胞組與細胞支架組D值比較無統(tǒng)計學意義(P=0.066,P0.05),表示絲素蛋白支架對基因轉染后的hUCMSCs的生長活性無明顯影響。4.油紅O染色顯示,兩組移植物均呈陽性,證明移植物已在體內分化為脂肪組織,且轉染組脂肪樣細胞數量明顯高于對照組,有顯著性統(tǒng)計學差異(0.01)；HE染色顯示,兩組移植物組織結構與正常脂肪組織相似,組織內及其周圍可見明顯新生血管,未降解支架材料周圍有炎性細胞浸潤,轉染組支架材料降解明顯,炎性細胞浸潤明顯少于對照組,新生血管數量也多于對照組；掃描電鏡觀察提示,兩組移植物內可見脂肪樣細胞和新生血管,轉染組移植物內脂肪樣細胞聚集成團,其結構與正常脂肪組織相似,而對照組脂肪樣細胞散在分布于支架孔隙內。 結論：1.胰島素基因能明顯促進hUCMSCs成脂肪化,攜帶重組人胰島素基因慢病毒載體轉染的hUCMSCs能有效地與絲素蛋白支架在體外構建組織工程化脂肪。2.攜帶重組人胰島素基因慢病毒載體轉染的hUCMSCs與絲素蛋白支架復合后,在Wistar大鼠體內能構建出組織工程化脂肪組織,其結構類似正常脂肪組織。
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【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R318.1

【參考文獻】

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本文編號：2263699