【摘要】：背景 鈦及鈦合金因其良好的物理性能和生物相容性已被廣泛應(yīng)用于內(nèi)植物中,但仍有一部分病例因骨整合不良、感染等而導(dǎo)致內(nèi)植物松動(dòng)失敗,因此鈦表面改性一直是國(guó)內(nèi)外內(nèi)固定材料領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。材料的表面特性如材料表面形貌對(duì)其骨整合能力有很大影響,學(xué)者們采用多種方法改變骨植入材料的表面形貌以提高其生物性能。天然骨是羥基磷灰石、膠原以及其它生物分子組成的復(fù)合納米結(jié)構(gòu),因而相對(duì)于宏觀和微觀尺度的內(nèi)植物表面,骨細(xì)胞更適應(yīng)于具有納米級(jí)粗糙植入體表面。鈦植入材料表面納米結(jié)構(gòu)化是改進(jìn)其生物活性和增強(qiáng)其骨整合能力的重要途徑。其中,氧化鈦納米管(TiO2-NT)涂層成為近來(lái)該領(lǐng)域研究中的熱點(diǎn)。 通過(guò)改變陽(yáng)極氧化電壓的高低能有效調(diào)節(jié)TiO2-NT直徑大小。不同直徑TiO2-NT對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的成骨性能研究有一些,但是直徑大小和成骨能力強(qiáng)弱關(guān)系還存在爭(zhēng)論。內(nèi)植物的整合關(guān)系骨形成和骨吸收兩方面,TiO2-NT直徑大小和破骨細(xì)胞形成及活性的研究則很少。 鋅(Zn)是骨形成過(guò)程中的一重要的微量元素并且對(duì)成骨細(xì)胞活性,堿性磷酸酶活性和膠原合成非常重要。Zn的抗菌活性在含zn的材料中被觀察到。zn陶瓷和磷酸鋅因?yàn)槟芫徛尫懦鲆种萍?xì)菌增值的zn離子而被廣泛應(yīng)用到臨床中。因此通過(guò)Zn在TiO2-NT中的加載及緩釋有可能提高內(nèi)植物的骨整合和抗感染能力。 鍶(Sr)是目前已應(yīng)用于臨床的唯一能促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的抗骨松藥物。口服Sr劑會(huì)引起惡心、腹瀉、頭痛等不良反應(yīng)。將Sr加載到TiO2-NT中,通過(guò)局部緩釋作用,可能形成一種能有效促進(jìn)骨質(zhì)疏松患者骨整合的內(nèi)植物材料。 目的 制備不同直徑TiO2-NT涂層并研究直徑大小對(duì)成骨細(xì)胞活性的作用及對(duì)破骨細(xì)胞形成和活性的影響。將Zn加載到TiO2-NT中,研究其骨形成和抗菌活性。將Sr加載到TiO2-NT中,探討對(duì)破骨細(xì)胞形成和活性的作用及在骨質(zhì)疏松大鼠模型體內(nèi)植入后內(nèi)植物的骨整合情況。 方法 用陽(yáng)極氧化方法制備TiO2-NT,場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察制備的TiO2納米管的管徑大小、管的完整性和膜的均勻程度等。 在10、40和60v電壓下陽(yáng)極氧化生成不同直徑的TiO2-NT。體外實(shí)驗(yàn)中,骨髓單核細(xì)胞(BMMs)培養(yǎng)到樣品表面行破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng),觀察不同直徑納米管樣品表面破骨細(xì)胞形成,TRAP活性和染色,破骨細(xì)胞活性相關(guān)基因表達(dá)。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)接種到樣品表面觀察細(xì)胞外基質(zhì)礦化情況。 通過(guò)在醋酸鋅溶液中水熱的方法將Zn加載到TiO2-NT中,不同水熱時(shí)間下以獲取不同的加載量。體外實(shí)驗(yàn)行蛋白粘附檢測(cè),DAPI計(jì)數(shù)細(xì)胞粘附,LDH試劑盒測(cè)細(xì)胞毒性,CCK-8法測(cè)細(xì)胞增殖,電鏡觀察細(xì)胞形態(tài),試劑盒檢測(cè)細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá),茜素紅染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)礦化,對(duì)培養(yǎng)液中浮游及粘附細(xì)菌抗菌活性檢測(cè)和細(xì)菌培養(yǎng)皿中抗菌情況進(jìn)行觀察。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中內(nèi)植物植入大鼠脛骨中微CT檢測(cè)骨參數(shù),生物力學(xué)儀檢測(cè)最大拔出力。 通過(guò)在Sr(OH)2溶液中水熱的方法將Sr加載到TiO2-NT中,不同水熱時(shí)間下以獲取不同的加載量。體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞骨架熒光染色加DAPI染色觀察材料表面破骨細(xì)胞形成,TRAP染色觀察樣品周圍破骨細(xì)胞形成。TRAP活性檢測(cè)和骨吸收實(shí)驗(yàn)檢測(cè)破骨細(xì)胞活性。建立骨質(zhì)疏松大鼠模型并將材料植入脛骨上端,行微CT和骨切片觀察內(nèi)植物周圍骨整合并行骨參數(shù)檢測(cè)。 結(jié)果 直徑約為30nm、80nm和120nm的TiO2-NT通過(guò)分別在10v、40v和60v電壓條件下通過(guò)陽(yáng)極氧化的方法制備而成。在Ti基底的表面引入TiO2-NT顯著地減少了破骨細(xì)胞形成數(shù)目和活性,明顯增強(qiáng)了MSCs的成骨活性。隨著納米管直徑的增加,破骨細(xì)胞的數(shù)目、TRAP染色和TRAP活性、破骨細(xì)胞活性相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)一步受到抑制,而MSCs礦化活性逐漸增強(qiáng)。 Zn通過(guò)水熱的方法加載到TiO2-NT內(nèi)壁上,加載的Zn的量可以通過(guò)調(diào)節(jié)水熱處理的時(shí)間來(lái)調(diào)節(jié)。MC3T3-E1的礦化隨著Zn的加載而增強(qiáng)。植入大鼠體內(nèi)四周后,鈦納米管材料內(nèi)植物的周圍有更多的骨小梁形成并且骨整合的參數(shù)得到了增強(qiáng),特別是在zn加載后效應(yīng)更加明顯。培養(yǎng)液中浮游細(xì)菌,樣品表面粘附細(xì)菌及和樣品接觸的細(xì)菌固體培養(yǎng)基表面的細(xì)菌生長(zhǎng)被NT-Zn顯著抑制。 在含Sr的溶液中水熱處理后,Sr加載到TiO2-NT中形成NT-Sr。SEM圖像顯示Sr分布于納米管的外側(cè)和內(nèi)壁中。在PBS溶液中浸泡的方法顯示了Sr的緩慢釋放過(guò)程。在體外實(shí)驗(yàn)中,NT-Sr樣品表面和樣品周圍的破骨細(xì)胞形成及活性受到了明顯地抑制。通過(guò)雙側(cè)卵巢切除的方法建立了大鼠骨質(zhì)疏松模型并將內(nèi)植物植入大鼠脛骨中。微CT和骨切片檢測(cè)到NT-Sr內(nèi)植物周圍骨小梁、骨量和骨整合明顯加強(qiáng)。 結(jié)論 TiO2-NT能夠抑制破骨細(xì)胞形成和活性。另外,我們可以通過(guò)調(diào)整納米管直徑的大小改變破骨細(xì)胞的形成和活性。隨著納米管直徑的增加,MSCs成骨分化活性增強(qiáng)。總的來(lái)說(shuō),大直徑的納米管內(nèi)植物材料如NT60可以更好地抑制骨吸收和加強(qiáng)骨形成,從而能夠更好預(yù)防內(nèi)植物的松動(dòng)和失敗。 Zn通過(guò)在醋酸鋅溶液中水熱的方法加載到TiO2-NT中形成NT-Zn。NT-Zn不僅在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)骨形成進(jìn)而加強(qiáng)骨和內(nèi)植物的整合,而且有效抑制細(xì)菌的增殖從而預(yù)防內(nèi)植物感染的發(fā)生。 NT-Sr通過(guò)TiO2-NT于Sr溶液中水熱處理的方法形成并能緩慢釋放出Sr。體外實(shí)驗(yàn)中NT-Sr表面及周圍破骨細(xì)胞形成和活性受到抑制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,NT-Sr表面骨量明顯增多,骨小梁參數(shù)增強(qiáng),擁有更好的骨整合。NT-Sr的效應(yīng)隨著加載的Sr量增多而加強(qiáng)。NT-Sr涂層形成簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)有效,可能成為骨質(zhì)疏松癥患者一種較為理想的內(nèi)植物材料。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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1 于曉琳;鄧飛龍;;陽(yáng)極氧化法制備的二氧化鈦納米管在鈦表面改性中的研究進(jìn)展[J];國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2012年01期

2 李寧華,區(qū)品中,朱漢民,楊定焯,鄭，

本文編號(hào)：2251845